共存陽離子對砷、硒和釩毒性效應的影響及預測模型研究

夏冰，陳紅楓，應蓉蓉，金淑，龔冰，季節，仇浩

1. 安徽省環境科學研究院，合肥 230071 2. 生態環境部南京環境科學研究所，南京 210042 3. 國家環境保護土壤環境管理與污染控制重點實驗室，南京 210042 4. 上海交通大學環境科學與工程學院，上海 200240

在自然界中，雖然大部分金屬以陽離子形式存在，也有相當一部分(類)金屬以含氧陰離子形式存在。其中，砷(As)是世界范圍內普遍存在的含氧陰離子型金屬。近年來，它所引發的環境污染問題受到人們的廣泛關注。As主要通過各種金屬開采與冶煉、農藥噴灑以及木材防腐劑的施用等人為活動進入并污染土壤環境[1]。據報道，As在全球土壤中的平均濃度為5 mg·kg-1，在土壤溶液中可達171 μg·L-1[2]。據《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，我國土壤污染總體狀況堪憂，總超標率為16.1%，其中As的點位超標率達2.7%，僅次于Cd(7.0%)和Ni(4.8%)[3-4]。As一旦進入食物鏈就可能引起公共健康問題[5]。研究表明，在人口稠密的地區(尤其是南亞地區)，由于飲用水和地下水受到天然來源的As污染，當地居民處于As暴露引發的高環境風險中[6]。與As不同，Se是從藻類到哺乳動物等許多生命體代謝所需的微量元素[7]。環境中Se的來源可分為自然源(如火山噴發、巖石風化等)和人為源(如含Se煤炭或石油的燃燒等)2類[8]。全球土壤中的Se濃度通常為0.05～1.5 mg·kg-1，具體含量取決于土壤特性[9]。以中國中部地區土壤為參考，土壤溶液中的Se濃度為0.51～27.64 μg·L-1[10]。我國幅員遼闊，土壤Se含量分布不均，出現了既有缺Se相關疾病(大骨節病與克山病等)的高發區，又有Se中毒相關疾病的高發區[11]。此外，V也是一種常見的陰離子型金屬，與As和Se相比，V是三者中自然豐度最高的(類)金屬。V在上層地殼中的平均含量大約為97 mg·kg-1[12]，在歐洲典型土壤溶液中為0.1 mg·L-1[13]。土壤V污染主要來自于采礦冶煉、化石燃料燃燒、化肥和農藥的施用等人為活動[14]。在中國西南部采礦和冶煉地區的V污染土壤中，其含量高達4 794 mg·kg-1[15]。以As、Se和V為代表的陰離子型金屬在土壤中不斷累積，對生態環境安全乃至人體健康造成的危害不容小覷。因此，亟待研究陰離子型金屬的生態毒性效應機制及影響因素并建立相應的預測模型，這對于建立有關環境質量標準和風險評價體系具有非常重要的意義。

在土壤中，陰離子型金屬的毒性受到了多種環境因素的影響，其中土壤溶液中的共存陽離子是陰離子型金屬毒性的一類重要影響因素[16]。在含有Ca2+、Mg2+、Na+和K+的硬水中，Se、Sb、Cr、Mn、V、Mo和W對淡水端足蟲(Hyalellaazteca)的毒性均高于不含這些陽離子的軟水，而軟水中As毒性卻更大[17]，可見共存陽離子對于陰離子型金屬毒性的影響并不一致。另外在土壤體系中，Ca2+可通過與V形成難溶性鈣鹽的方式降低V的遷移性與生物有效性[18]。Mg2+、K+和Fe3+主要通過調節細胞解毒代謝過程和改變細胞膜強度等途徑間接影響V毒性[19]。目前，對共存陽離子在As、Se和V毒性中發揮的作用仍知之甚少[20]。由于轉運通道和結合點位的不同，共存陽離子與陰離子型金屬之間一般不存在明顯的特異性競爭關系，陽離子更多是通過非特異性或間接的方式影響其毒性，并無定論。在自然環境介質條件下，幾乎所有生物的細胞質膜和細胞壁膜表面都帶有負電荷，這是由于細胞膜蛋白上的氨基酸殘基、膜磷脂的磷酸基團及細胞壁果膠上的羧酸等基團水解造成的。這些電荷在質膜外表面形成的電勢稱為質膜表面電勢，用φ0(通常小于0)表示[21]，這會導致外部溶液中的共存陽離子與質膜表面因為靜電作用產生吸引力，從而改變φ0，進而影響細胞質膜表面的自由金屬離子活度[22-23]。研究發現溶液中共存陽離子(Al3+、Ca2+和Mg2+等)的增加會通過靜電作用降低小麥(TriticumaestivumL.)根部φ0從而加劇As和Se的毒性，而這種對表面電勢的改變程度更多取決于非特異性的陽離子電荷量[24-25]，靜電作用可以很好地解釋共存陽離子對陰離子型金屬毒性的影響。

Kinraide[21]、Wagatsuma和Akiba[26]將質膜表面電勢效應對毒性的影響納入考慮，構建了能夠有效預測金屬毒性的靜電作用模型(electrostatic toxicity model, ETM)。近年來，已有越來越多的研究從φ0角度考慮了離子之間的交互作用及其與生物效應之間的關系。例如在水培和土壤體系中，學者發現φ0在Ni2+對大麥的毒性中起著“雙重作用”。首先，由于添加了Ca2+、Mg2+和H+等，φ0的電負性降低，從而降低了細胞質膜表面的Ni2+活度。其次，通過添加陽離子，φ0可能會增加細胞質膜表面的跨膜電位差，這是跨膜吸收Ni的驅動力。因此，Ni的毒性是膜表面電勢φ0引起的雙重作用的結果[27]。Kopittke等[28-29]利用ETM模型成功解釋了不同暴露介質中Cu、Pb和Mn的毒性效應。Wang等[30]也驗證了靜電作用理論對Cu、Ni、Zn和Mn等多種金屬毒性預測的適用性。盡管在陽離子型金屬毒性預測方面，ETM模型已被證明是行之有效的[31-32]，但此模型對陰離子型金屬是否有效尚待研究。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗設計及測試溶液配制

本研究所用試劑除特別說明外，均購自國藥集團化學試劑有限公司，級別為分析純試劑。

取一定量儲備液，并用營養液(含0.2 mmol·L-1CaCl2和5 μmol·L-1H3BO3)稀釋定容以得到不同濃度組合的測試溶液。所有測試溶液在小麥毒性暴露實驗開始前24 h內，用稀鹽酸或氫氧化鈉溶液將pH調節至6.0±0.1，以0.75 mg·L-12-(N-嗎啉代)乙烷磺酸(MES)溶液為緩沖溶液。之所以將測試溶液的pH控制在6.0左右，一方面是由于弱酸性環境(pH 5.0～6.0)有利于植物的生長[31]，另一方面是由于許多相關研究中pH均為6.0，使用相同的pH值有利于研究結果的比較和外推[23, 27, 31]。

1.2 毒性測試

種子萌發和幼苗生長是作物響應外部環境脅迫的開始，也是作物對外界刺激最敏感的時期。作為陸生生態毒理學研究中常見的模式植物，小麥幼苗的毒理實驗可為金屬污染早期診斷提供有效數據[23]。因此，本研究參照ISO標準(111269-1)進行小麥根伸長毒性試驗[34]。取適量小麥(TriticumaestivumL.)種子(品種為NAU 9918，購買于南京農業大學)，在1%的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒15 min。用去離子水清洗數遍以去除殘留的次氯酸鈉后，將小麥種子在預先配制的小麥催芽浸種營養液中浸泡4 h以保證后續種子能夠均勻發芽。催芽浸種營養液為調整后的Hoagland溶液，具體配方為0.3 mmol·L-1Ca(NO3)2、0.2 mmol·L-1MgSO4、1.2 mmol·L-1KNO3、15 mmol·L-1H3BO3、5 μmol·L-1KH2PO4、0.07 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24、5 μmol·L-1MnSO4和10 μmol·L-1C18H16FeN2NaO6(EDDHA-FeNa)。隨后小麥種子移入鋪有濕濾紙的發芽盤中，在20 ℃無光照的條件下發芽約60 h，期間噴灑催芽浸種營養液以保持濕潤。待小麥種子根部長至1.0～1.5 cm，將其移入裝滿提前配制的不同濃度培養溶液的250 mL玻璃燒杯中，用剪口的封口膜將種子固定在杯口液面附近，以保證小麥根部充分浸潤在培養溶液中且其他部位不與溶液接觸。每個250 mL燒杯放置4顆種子，且燒杯用鋁箔紙包裹外壁以避免光照，從而模擬真實土壤環境。每一種暴露條件設計3個平行樣本，即3個裝滿培養溶液燒杯，共計12顆種子。隨后將種有小麥的燒杯移入人工氣候箱(RXZ-1000F-4型，浙江省寧波市新江南儀器有限公司)進行為期4 d的急性毒性暴露實驗[34]，培養條件設置為溫度20 ℃、濕度75%、晝夜循環16 h∶8 h以及光照強度52 000 lx。

暴露結束后測量每株小麥的最大根伸長。以每個影響因子濃度各自對照組的平均最大根伸長為對照，計算相應的相對根伸長(relative root elongation, RRE)作為本實驗的毒性指示終點，計算方法如公式1所示。

“自采”的僅計算基本直接費，“他采”的還應計算相關費用、利潤及稅金。考慮到這兩種情況下主承包人的成本支出差異，應同時制定這兩種情況下的混凝土工程費率，“自采”的比“他采”的要高些。

(1)

式中：REA為測試組同一燒杯中4株小麥最大根伸長的平均值(cm)；REC為對照組同一燒杯中4株小麥最大根伸長的平均值(cm)。

1.3 化學測試與形態分析

測試溶液中As、Se和V這3種陰離子型金屬與影響因子Ca、Mg、Na和K的總濃度由電感耦合等離子體發射光譜(ICP-OES，iCAP7600，Thermo Fisher)進行測定。ICP-OES的工作參數為射頻功率1 150 w、霧化器流量0.70 L·min-1和輔助器流量0.50 L·min-1，As、Se和V的檢出限分別為0.03、0.06和0.003 μg·mL-1，加標回收率為96.5%～102.1%。所有溶解濃度表述為[M]diss。暴露實驗前后培養溶液的pH值由pH計(pH510型，上海安萊立思儀器科技有限公司)測定。

1.4 數據分析與建模

1.4.1 劑量-毒性效應模型

污染物劑量與其毒性效應之間的數量關系常用Logistic公式進行擬合，本實驗用相對根伸長RRE作為毒性效應指標。本研究中采用的Logistic公式描述如下：

(2)

式中：xi為劑量表達方式，本實驗中為自由離子活度和質膜表面金屬活度；xi50為半數有效劑量，在引起根伸長相比對照值減小50%時的金屬劑量；β為斜率參數。

1.4.2 靜電作用模型(ETM)

該模型基于植物根部質膜表面帶負電這一原理，認為帶負電的質膜與陰、陽離子之間的排斥、吸引會改變φ0，從而使質膜表面真實的金屬自由離子活度與外部溶液中的不同，所以質膜表面的自由金屬離子活度更能準確反映金屬毒性。基于此原理，本實驗中共存陽離子易被吸引到質膜表面從而降低φ0，影響陰離子型金屬在質膜表面的濃度及其毒性。

表1 單一變量控制實驗測試溶液濃度設計Table 1 The concentration sets of test solutions for univariate experiments

φ0可由Kinraide[21]提出的計算公式或相關計算軟件Gouy-Chapman-Stern(SGCS)[35-36]獲得，本研究中φ0通過在線SGCS程序(http://www.uq.edu.au/agriculture/sgcs/)計算得到。已知φ0后，質膜表面的自由金屬離子活度可由能斯特方程求出，如公式3所示。

(3)

式中：{M}0為質膜表面的陰離子型金屬活度；{M}為外部溶液中的陰離子型金屬活度(即形態計算求出的活度)；Z為電荷數；F為法拉第常數(C·mol-1)；φ0為質膜表面電勢(V)；R為氣體常數(J·mol·K-1)；T為實驗溫度(K)。

劑量-響應曲線由Origin 9.0軟件進行擬合，其擬合度(Adj.R2)可以反映該劑量能否準確預測毒性效應；斜率參數(β)、半數有效濃度(EC50)值(xi50)可通過基于全局擬合的多元非線性回歸方法得到，擬合時使均方根誤差(RMSE)最小。其中xi50代表了該污染物的毒性大小，可用于本研究中3種陰離子型金屬毒性大小的比較。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 共存陽離子對As、Se和V毒性的影響

決定金屬毒性的一個重要方面是其生物有效性，而環境中金屬的形態與其生物有效性和毒性有直接的關系，金屬總濃度不能作為指示其潛在毒性效應的有效指標[37]。基于溶解態金屬濃度造成的毒性影響可能小于實際的毒性效果，即金屬的溶解態濃度也不足以解釋實際的毒性效應[38]。自由離子態金屬被證明是水體和土壤孔隙水中具有生物有效性和產生毒性作用的主要形態[39]。因此，本研究中我們均采用自由離子活度為劑量表達方式進行分析。通過單一變量控制實驗得到了關于環境共存陽離子Ca2+、Mg2+、Na+和K+對As、Se和V毒性影響的實驗結果，如圖1所示。

在本研究中，我們計算了φ0與其表面Ca2+、Mg2+、Na+和K+活度之間的關系(圖2)。在空白對照組中(無As、Se和V)，當CaCl2的添加范圍為0.2～15 mmol·L-1時，φ0從-41.5 mV增大到-10.1 mV；當MgCl2的添加范圍為0.2～4 mmol·L-1時，φ0從-42.1 mV增大到-22.2 mV；同樣，對于Na組，當NaCl的添加范圍為0～16 mmol·L-1時，φ0從-41.9 mV增加到-32.5 mV。當KCl的添加范圍為1.2～9.6 mmol·L-1時，φ0從-42.8 mV增加到-34.1 mV。在4種共存陽離子中，Ca2+的引入最大程度地降低了φ0的電負性，使得質膜表面對陰離子型金屬的排斥力減小從而增大質膜表面的自由離子活度、增大毒性。這種對表面電勢電負性減小的作用還存在“雙重效應”[30]，會使得離子跨過質膜的驅動力同樣減小，導致陰離子型金屬毒性減弱。此外，Ca2+作為植物必需營養物質還可強化細胞壁、穩定細胞膜[47]，也可通過調節抗氧化酶或抗氧化物質從而提高質膜對氧化損傷的抵御[48]，也即Ca2+能通過提高植物自身耐受性減弱金屬的毒性。值得注意的是，這幾種原因均為非特異性的作用，會導致Ca2+對陰離子型金屬毒性的影響有不同的可能性，這可以解釋Ca2+對于As、Se和V毒性全然不同的影響(圖1(a)、(e)、(i))。和Ca2+相同，Mg2+對于陰離子型金屬毒性的影響也具有非特異性作用，即通過減小φ0的電負性增加質膜表面陰離子金屬活度，使毒性加劇；同時減小跨膜驅動力，導致毒性減小。不同的是，Se(Ⅳ)在低濃度下是植物生長的微量營養元素，Se(Ⅳ)與Mg吸收之間存在正相關關系[49]，這可能會導致Mg濃度增加時Se吸收量和毒性也隨之增加。而Na+與K+的加入對As、Se和V三者的毒性均沒有顯著影響，這可能與一價陽離子的引入對φ0的改變不大有關。

圖1 不同共存陽離子自由活度與陰離子型金屬毒性(半數效應濃度值)的關系注：(a)～(d) As；(e)～(h) Se；(i)～(l) V。Fig. 1 Relationships between the median effect concentration values of anionic metals and free ion activities of coexisting cationsNote: (a)～(d) As; (e)～(h) Se; (i)～(l) V.

2.2 靜電作用模型預測共存陽離子影響下陰離子型金屬毒性

根據ETM原理，溶液中的共存陽離子被吸引到原本帶負電的植物根部表面后，會降低表面電勢從而減小對陰離子的排斥，增大陰離子在質膜表面的濃度，因此，陰離子型金屬的毒性理論上應隨環境共存陽離子濃度的增大而增大。而事實上，本研究僅在V-Ca組與Se-Mg組中觀察到了共存陽離子的加入顯著增強了陰離子型金屬的毒性。因此，我們針對符合靜電作用理論的V-Ca組與Se-Mg組進行表面電勢與質膜表面金屬陰離子濃度的計算，構建相應的ETM分別對Se和V的毒性進行定量預測(圖3)。由圖3可知，實線代表基于同一處理組中所有數據擬合得到的Logistic回歸曲線。結果顯示，分別將Mg2+對{Se}0的影響以及Ca2+對{V}0的影響納入考慮所構建的ETM可以實現Se(Adj.R2=0.95)和V(Adj.R2=0.88)毒性的定量預測，靜電作用理論能夠成功地解釋Mg2+(或Ca2+)在加劇Se(或V)對小麥毒性中發揮的作用。Se-Mg與V-Ca的劑量-響應曲線導出的EC50值分別為9.33 μmol·L-1和42.49 μmol·L-1(以質膜表面活度表示)。由于質膜表面對陰離子的排斥，質膜表面的陰離子活度比溶液中的活度小，因此這2個EC50值相比于以自由離子活度表示的EC50值也更小。對于包括植物根部在內的大多數生物體而言，陰、陽離子進入細胞的通道不同且幾乎不重合，相比之下，陽離子通道的選擇性更高(如鈣離子通道、鈉離子通道等)，而陰離子通道則未見對于含氧陰離子各形態選擇性的報道。正是由于陰離子型金屬與環境共存陽離子之間缺乏特異性的交互作用，使得環境共存陽離子與陰離子型金屬毒性之間的影響關系難以定性為競爭等交互關系并進行定量計算，而只能對非特異性的作用進行描述。

圖2 質膜表面電勢(φ0)與Ca2+、Mg2+、Na+和K+活度之間的關系Fig. 2 The correlation between the calculated plasma membrane surface potentials (φ0) and the activities of Ca2+, Mg2+, Na+, and K+

整體而言，ETM模型基于φ0和質膜表面的金屬離子活度，揭示了質膜表面電勢的靜電效應是共存陽離子緩解陽離子型金屬毒性和加劇陰離子型金屬毒性的主要作用機制，該模型在陽離子型和陰離子型金屬毒性預測方面均具有一定潛力，是研究金屬離子生物毒性的有效工具。值得注意的是，本研究所構建的ETM模型是基于短期暴露實驗所獲得的陰離子型金屬毒性信息，其對長期暴露下該金屬風險評估的適用性有待進一步研究。

圖3 質膜表面活度與相對根伸長(RRE)之間的劑量-響應曲線注：(a) Se-Mg；(b) V-Ca。Fig. 3 Dose-response curves between metal(loid)s activities at the plasma membrane and relative root elongation (RRE)Note: (a) Se-Mg; (b) V-Ca.

(1) 首先明確了陰離子型金屬As、Se和V毒性的主控環境因子。在Ca2+、Mg2+、Na+和K+中，Ca2+顯著降低了As毒性，顯著增加了V毒性，對Se毒性無顯著影響；Mg2+顯著增加了Se毒性。Ca2+對As、Se和V毒性的這3種全然不同的影響可能是以下3個方面因素綜合作用的結果：由于Ca2+減小了原本帶負電的質膜表面的電勢，使得質膜表面對陰離子型金屬的排斥力減小從而增大其在質膜表面的活度、增大毒性；這種對表面電勢電負性的減小作用還存在“雙重作用”會使得離子跨過質膜的驅動力同樣減小，導致陰離子型金屬毒性減弱；Ca2+作為植物必需營養物質可強化細胞壁、穩定細胞膜，也可通過調節抗氧化酶或抗氧化物質從而提高質膜對氧化損傷的抵御。

(2) 針對符合靜電作用理論的V-Ca組與Se-Mg組進行表面電勢與質膜表面陰離子型金屬活度的計算，成功構建了能夠定量預測Mg2+共存時Se毒性以及Ca2+共存時V毒性的靜電作用模型。

陽離子型金屬毒性及其影響因素研究廣泛，但是針對陰離子型金屬毒性的相關研究仍較為匱乏，我們的研究結果為陰離子型金屬毒性的量化預測提供了新思路，為建立陰離子型金屬污染土壤環境質量標準與風險評估體系提供了科學依據。

通訊作者簡介：應蓉蓉(1984—)，女，博士，副研究員，主要研究方向為生態毒理學。

共同通訊作者簡介：金淑(1992—)，女，博士，助理研究員，主要研究方向生態保護與農村環境。