基于生物信息學的糖尿病腦病關鍵基因與通路篩選及中藥預測的研究

石崯力 王旭

摘要 目的：基于生物信息學方法對糖尿病腦病（DE）的關鍵基因進行初步篩選，探索與其相關的潛在靶點、生物過程及通路，進而預測治療DE的潛在中藥。方法：運用GEO數據庫篩選出基因芯片原始數據集GSE161355作為樣本進行研究。基于R Studio軟件的質量評估和差異分析篩選差異基因，應用DAVID數據庫進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，利用Cytoscape軟件進行關鍵靶點篩選及關鍵功能模塊構建、可視化。通過將關鍵靶點與Coremine Medical數據庫相互映射，篩選治療DE的潛在中藥。結果：通過對GSE161355基因原始數據集的預處理，從DE患者中篩選出326個顯著性差異基因，差異基因主要參與學習、記憶、神經元突觸傳遞、細胞分裂、蛋白質分泌、血管生成調節等生物過程，與神經活性配體-受體信號通路、細胞周期通路等存在關聯。蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡顯示MCHR2、CXCR2、GNAI1、P2RY13、NPY1R、C3、LPAR4、OXTR、CHRM5、CDC7、ORC5、ORC4、CCNA1可作為治療DE的潛在靶點，多方位、多維度、多層面參與炎癥反應、細胞凋亡、內質網應激、血管生成等生物過程。通過中藥預測篩選發現人參、熟地黃、西紅花、銀杏葉、黃連、郁金等可作為潛在來源。結論：通過對顯著性差異基因和潛在核心靶點的分析促進了對DE發病機制的進一步理解和探索，為今后治療和評估提供了新的方向和臨床依據。

關鍵詞 生物信息學;糖尿病;腦病;糖尿病腦病;差異基因;作用機制;中醫治療;中藥預測

Screening of Key Genes and Pathways Related to Diabetic Encephalopathy Based on Bioinformatics and Prediction of Effective Chinese Medicinals

SHI Yinli，WANG Xu

（The First School of Clinical Medicine of Nanjing University of Chinese Medicine，The Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China）

Abstract Objective：This study aims to screen key genes related to diabetic encephalopathy（DE），potential targets of the genes，and biological processes and pathways of the genes based on bioinformatics，and thereby predict potential effective Chinese medicinals.Methods：The microarray dataset GSE161355 was screened from Gene Expression Omnibus（GEO） for analysis.Differently expressed genes were yielded based on quality evaluation and difference analysis by R Studio，and DAVID was employed for Gene Ontology（GO） term enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analysis.Cytoscape was applied to screen key targets and visualize key functional modules.By mapping key targets with the Coremine Medical，we screened potential Chinese medicinals for the treatment of DE，and constructed the “potential medicinal-active component-core target” network.Results：A total of 326 significantly differential genes were screened out，which were involved in the biological processes such as learning，memory，synaptic transmission of neurons，cell division，protein secretion，and angiogenesis regulation，and the pathways of neural active ligand-receptor interaction，cell cycle，and other pathways.The protein-protein interaction（PPI） network showed MCHR2，CXCR2，GNAI1，P2RY13，NPY1R，C3，LPAR4，OXTR，CHRM5，CDC7，ORC5，ORC4，and CCNA1 were potential targets against DE，which were involved in inflammation，cell apoptosis，endoplasmic reticulum stress，angiogenesis，and other biological processes from multiple aspects.Radix Ginseng，Radix Rehmanniae Preparata，Stigma Croci，Folium Ginkgo，Rhizoma Coptidis，and Radix Curcumae were effective medicinals，which nourish qi，blood，yin and yang，promote blood circulation，remove blood stasis，dredge collaterals，resolve phlegm，refresh the brain，and resuscitate.Conclusion：This study further clarified the pathogenesis of DE through the analysis of differentially expressed genes and potential core targets，which provides a new theoretical research direction and clinical basis for future treatment and prognosis evaluation.75F30330-E95D-4C6C-AB27-FB800CFFDFFD

Keywords Bioinformatics; Diabetes Mellitus; Encephalopathy; Diabetic encephalopathy; Differentially expressed genes; Mechanism; TCM treatment; Chinese medicinal prediction

中圖分類號：R285;R587文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.004

糖尿病腦病（Diabetic Encephalopathy，DE）是糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）常見的慢性并發癥之一，是DeJong于1950年在一例嚴重的中樞神經系統異常的糖尿病患者病例中發現，并由此創造“糖尿病性腦病”這一概念[1]。一項對230萬人的匯總分析發現，患有糖尿病的個體罹患癡呆的風險較正常個體要高出60%，且在女性中尤為顯著[2]。現代研究認為，DE是患者處在長期高糖狀態下導致中樞神經系統的正常生理結構和功能遭受破壞，神經電生理和影像學出現異常改變（如腦組織彌漫性改變、齒狀核萎縮、軟腦膜纖維化和血管病變）的一種神經系統并發癥。患者出現不同程度的認知功能障礙包括學習、空間和記憶能力減退、健忘，嚴重者可進展至不可逆性癡呆，對患者的預后產生不良影響[3]。DE是多成分、多靶點、多通路作用形成的復雜的中樞神經系統疾病，目前尚無針對DE的西醫診療方案，而中醫通過辨證論治，認為DE以痰濕、瘀血、濁毒等侵犯機體，腎氣虧損，氣血運行不足，髓海空虛，神機失用為發病的基本病機，其病位在腦，與脾、腎多臟腑密切相關。越來越多的證據表明，中醫藥可通過調控神經細胞炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡、內質網應激等多個生理病理環節進而起到治療DE的作用[4-6]，但其具有未知性、復雜性的特點，使得中醫藥治療DE的藥理效應及機制的具體闡述仍有欠缺。生物信息學是將生物學、計算機信息學、網絡技術等多學科交叉融合的一門綜合學科[7]，將生物信息學應用于中醫藥領域，已成為現代研究的主流趨勢。通過生物信息學方法對GEO數據庫中的原始芯片數據進行初步篩選與分析，挖掘引起DE發病的關鍵基因，并對關鍵基因的潛在生物過程與信號通路進行分析，通過關鍵基因對具有潛在作用效應的中藥進行預測，旨在揭示其復雜分子作用機制并為其進一步研究與臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 數據集獲取

以“diabetic encephalopathy”作為檢索詞，將種屬設置為“human sapiens”，在GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[8]中進行檢索。檢索后可獲得12個數據集，對其數據集的內容進行再次規范化篩選后，以數據集GSE161355表達譜芯片作為最終研究樣本，下載該基因表達譜芯片的表達矩陣與相關信息。

1.2 數據預處理

運用R Studio軟件安裝“Bioconductor”[9]“affyPLM”[10]“affy”“limma”[11]“pheatmap”和“ggplot2”[12]等相關擴展包。調用“Bioconductor”“affyPLM”“affy”包對GSE161355表達譜芯片進行包括質量控制、匯總探針集數據、計算基因表達數據、擬合回歸的分析，繪制芯片相對對數表達（Relative Log Expression，RLE）箱線圖、相對標準差（Normalized Unscaled Standard Errors，NUSE）箱線圖。RLE為一個探針組在某個樣品的表達值除以該探針組在所有樣品中表達值的中位數后取對數，反映了平行實驗的一致性。NUSE為一個探針組在某個樣品的PM值的標準差除以探針值在各樣品中的PM標準差的中位數，相較于RLE更為敏感，通過質量評估給予剔除降解嚴重的不可靠樣本;利用“affy”[13]包讀取經過質量控制處理后GSE161355的表達譜芯片數據，應用穩健多芯片平均標準化分析方法（Robust Mulitichip Average，RMA）對正常組樣本和DE組樣本進行處理后合并;運用最近鄰居法（K-nearest Neighbor，KNN）尋找原始數據的缺失值并對其進行補充;運用GPL570芯片平臺將Probe ID轉換為Gene Symbol，獲取經預處理后的標準化基因表達值。

1.3 差異表達基因篩選

基于R Studio軟件中的“limma”包對標準化后的GSE161355芯片表達譜進行差異分析，通過采用貝葉斯方法進行多重檢驗矯正，以|log2 FC|>1，P<0.05作為顯著差異基因的篩選條件。將篩選后的結果通過“pheatmap”“ggplot2”包進行可視化處理，以火山圖和熱圖的形式輸出。

1.4 差異基因的潛在代謝通路與生物過程分析

將獲得的顯著性差異基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）導入DAVID 6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）[14]，將“Gene List”及“Background”設置為“homo sapiens”。基于R Studio軟件的“ggplot2”擴展包進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，設定閾值P<0.05;下載“dplyr”“org.Hs.eg.db”安裝包，以閾值P<0.05進行關鍵基因基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，最終以條形圖和氣泡圖的形式輸出結果。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡構建 將獲得的顯著性差異基因導入String數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），選擇種屬為“homo sapiens”，篩選條件為“minimum required interaction score>0.9”，將得到的PPI關系導入Cytoscape 3.8.0軟件構建成分靶點和疾病靶點PPI網絡[15]，通過Degree值分析各靶點在PPI網絡中的重要程度[16];并通過分子復合檢測（Molecular Complex Detection，MCODE）插件對構建的PPI網絡進行模塊挖掘，篩選出其中關聯性強的PPI模塊[17]。參數設置為：degree=3，node score=0.2，k-core=2，max.Depth=100。75F30330-E95D-4C6C-AB27-FB800CFFDFFD

1.6 關鍵靶點對接及中藥預測

將篩選出的DEGs與DE相關的生物學過程導入Coremine Medical數據庫（https：//www.coremine.com/）[18]中，設置閾值條件為P<0.05，由此篩選出與關鍵基因和潛在生物學過程相關的中藥。從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[19]中根據閾值口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18篩選預測中藥的潛在化學成分，并運用Uniprot數據庫對獲得的有效靶點進行去重、規范化，將處理后的數據導入Cytoscape 3.8.0軟件中構建“中藥-有效成分-靶點”網絡圖，利用Cytoscape軟件中Hubba插件[20]的MCC≥3為篩選標準對排列前20的靶點進行篩選并進行可視化處理。

1.7 差異基因表達譜芯片的一般情況 該GSE161355表達譜芯片數據集來源于英國謝菲爾德大學神經病學觀察組，是由15例健康對照者與18例糖尿病患者的神經元、星形膠質細胞及神經血管內皮細胞組成。研究者將各組受試者的顳皮層細胞從體內提取出后在體外培養，通過免疫定向激光的方式捕獲、顯微切割、分離神經元、星形膠質細胞和內皮細胞。見表1。

2 結果

2.1 芯片數據質量評估

對GSE161355表達譜芯片的原始數據進行質量評估，得到RLE箱線圖。結果提示，該數據集中各樣本比值接近于1，對值接近于0，整體表達水平基本趨于一致。見圖1。NUSE箱線圖見圖2，結果表明，除了GSM4905229和GSM4905233樣本，其余31個樣本的基因表達標準差基本趨于一致，由此說明GSM4905229和GSM4905233這2個樣本質量較差，在后續的研究中應予以剔除。應用RMA法預處理及匯總剔除較差樣本后的數據，將芯片上的Probe ID轉化為Gene Symbol，并對數據集中存在缺失值的部分采用KNN法進行補充，最終匯總獲取20 461個基因表達水平數據。

2.2 差異基因篩選結果

通過將糖尿病組樣本與對照組進行比較，以P<0.05，|log2 FC|>1作為顯著差異基因的篩選條件，應用R Studio軟件進行分析，共篩選出326個DEGs，其中包含了309個表達上調基因及17個表達下調基因，表明正常個體與DE患者之間存在顯著差異性基因。所選數據集的火山圖和熱圖見圖3～4。

2.3 關鍵靶點的代謝通路與生物過程分析

將獲得的DEGs利用DAVID數據庫進行GO分析，結果可獲得30條GO富集功能，其中生物過程（Biological Process，BP）相關的條目最多，共18條，4條細胞組分（Cellular Component，CC）和8條分子功能（Molecular Function，MF）。以P<0.05為篩選條件選取GO條目，其涉及學習、記憶、神經元突觸傳遞、細胞分裂、蛋白質分泌、血管生成調節等生物學過程。運用R Studio軟件下的“ggplot2”擴展包對上述的分析結果進行可視化處理。見圖5。利用DAVID數據庫對DEGs進行KEGG通路分析，共獲得6條富集通路，以P<0.05為篩選條件選取共4條KEGG條目。分析結果提示核心靶點與神經活性配體-受體相互作用信號通路、細胞周期通路等有關，與此同時還與病毒感染性疾病、寄生蟲病、藥物使用等存在聯系。運用R Studio軟件下的“ggplot2”擴展包對上述的分析結果進行可視化處理。見圖6。

2.4 PPI網絡的構建與分析

利用String數據庫分別獲得DEGs之間的互作網絡，設置minimum required interaction score為highest confidence（0.9），將分析結果的TSV數據通過Cytoscape 3.8.0軟件中進行可視化，該PPI網絡中具有共有節點36個，43條邊，平均Degree值為2.38;運用CytoNCA插件以Degree值大于中位數為標準進行篩選出核心靶點13個：MCHR2、CXCR2、GNAI1、P2RY13、NPY1R、C3、LPAR4、OXTR、CHRM5、CDC7、ORC5、ORC4、CCNA1;基于MCODE插件對PPI網絡中的關聯性較強的模塊進行篩選，所得功能模塊最大者由6個節點，15條邊組成，score為6.0，該模塊即為PPI網絡中緊密聯系的區域。見圖7。

2.5 DE相關潛在核心靶點與生物學過程的中藥預測

通過Coremine Medical數據庫預測具有潛在治療DE的中藥，以P<0.05作為篩選標準，預測結果顯示多種中藥與NPY1R、LPAR4、OXTR、ORC5、DRD1、CDKN1A等核心靶點以及學習、記憶、細胞黏附、蛋白質水解等生物學過程關系較為密切。見表2。其中，人參、熟地黃等有補氣補血之效，銀杏葉、西紅花等為活血化瘀通絡之藥，白果取化痰開竅、補腎滋陰之功，黃連、積雪草清熱燥濕發揮降低血糖的作用，因此挑選上述中藥進行有效成分與靶點的驗證，構建“中藥-有效成分-靶點”作用網絡。見圖8。基于MCC算法應用Cytoscape軟件中的Hubba插件對前20的靶點進行篩選。其中顏色的深淺代表MCC評分的高低程度。結果表明人參、黃連、白果、銀杏葉等中藥的某些有效成分如槲皮素、山柰酚、豆甾醇、異鼠李素可通干預胰島素作用、炎癥反應、氧化應激等多條信號通路起到治療DE的作用。見圖9。

3 討論75F30330-E95D-4C6C-AB27-FB800CFFDFFD

DE是屬獲得性認知行為缺陷為特征的DM慢性并發癥之一，是由遺傳、肥胖、飲食、情緒、外部環境多種因素共同作用引起。DE的發病與糖脂代謝紊亂、胰島素作用異常、細胞凋亡、炎癥反應、過度氧化應激以及Tau蛋白異常磷酸化密切關聯[21]。利用生物信息學技術挖掘DE相關的基因表達譜，探索DE發生發展的潛在靶點與通路，尋求有效的干預中藥，為臨床研究提供了新的思路。

3.1 胰島素抵抗參與了DE的發生 胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）是DM和代謝綜合征發病的關鍵病理機制。長期的高糖環境使得胰島B細胞對葡萄糖的攝取利用率下降，腦內胰島素信號轉導出現異常，進而破壞神經遞質系統，引起細胞凋亡，加速β淀粉樣蛋白（Amyloid Protein，Aβ）在腦內異常堆積，影響了發揮認知功能的主要部位大腦組織海馬區神經元的形態與突觸的可塑性，最終導致患者出現認知功能缺失。海馬星形膠質細胞可因高血糖而造成損傷，改變谷氨酸能神經遞質傳遞和糖酵解途徑，抑制神經元-星形膠質細胞之間的能量代謝偶聯，導致細胞受到興奮性毒性影響，加速神經元的損傷與衰老[22-23]。通過對基因譜進行篩選發現，DEGs主要富集于胰島素抵抗、趨化因子釋放、炎癥反應、細胞凋亡等方面。黑色素濃集激素受體2（Melanin-concentrating Hormone Receptor 2，MCHR2）是一種存在于靈長類動物腦組織的受體，其高表達可增加肥胖與代謝紊亂的發病風險，調控MCHR2可激活黑色素濃集激素，由此調節下丘腦的能量消耗使機體的能量代謝平衡處于穩態[24]。實驗研究發現調控1型神經肽Y受體（Neuropeptide Y Receptor Type 1，NPY1R）的表達可抑制DM大鼠胰島B細胞過度分泌，改善IR，延緩認知和記憶功能衰退[25]。溶血磷脂酸受體4（Lysophosphatidic Acid Receptor4，LPAR4）作為LPA的受體亞族之一，可有選擇性地激活脂肪細胞，與Gα12/13蛋白產生偶聯，重塑脂肪組織架構而抑制IR[26]。KEGG分析結果表明，神經活性配體-受體相互作用信號通路在改善IR、保護受損的神經元方面起到了積極的作用。多巴胺D1受體（Dopamine D1 Receptor，DRD1）作為中樞神經系統重要的神經遞質，被認為與認知障礙的發生有關[27]。在膽堿能神經元廣泛分布的大腦區域，縮宮素受體（Oxytocin Receptor，OXTR）過表達，對改善IR、平衡能量代謝、削弱負面情緒等方面起到一定的作用[28]，可作為治療DE的潛在靶點之一。

3.2 細胞凋亡和炎癥反應是DE進展的重要環節? IR不僅可以引起機體糖脂代謝紊亂，可促進細胞凋亡和炎癥反應發生，影響著腦內神經系統的結構完整，阻礙神經系統功能的正常發揮，導致一系列神經系統疾病的發生。海馬區IR的發生促使了星形膠質細胞的激化與激活，加速趨化因子、炎癥介質的釋放，加重炎癥反應。應用MCODE方法對PPI網絡中連接緊密的潛在靶點進行提取，獲得了CHRM5、IL1B、CXCR2、C3、CDKN1A、HSPB1、ILF2等涉及炎癥反應、細胞凋亡的重要基因。CXCR2可與相應的趨化因子配體IL-8、CXCL2、CXCL3結合激活，驅動中性粒細胞、單核細胞、上皮細胞和巨噬細胞，其過表達可導致db/db小鼠加劇炎癥反應和糖脂代謝紊亂[29]。同時，C-X-C基序趨化因子受體2（C-X-C Motif Chemokine Receptor 2，CXCR2）通過核因子κB和PI3K-AKT等炎癥信號通路出現異位表達，誘發細胞出現過早衰老[30]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（Cyclin-dependent Kinase-inhibitor 1，CDKN1A）是細胞周期調節的重要蛋白之一，通過轉錄合成相關蛋白以調控在細胞的增殖、分化、衰老和凋亡。有研究表明，CDKN1A與2型糖尿病的發病存在密切的關系，其作用機制可能與延緩過度炎癥反應、調節血管生成和通透性相關[31]。

3.3 預測的中藥可能是治療DE的靶向藥物 中醫醫家認為DE病程日久，或因痰蒙神竅，或因瘀血阻絡，或因痰瘀毒互結，均會耗損陰陽，腎精不足，髓海空虛，故多表現健忘、精神恍惚、認知減退等。將預測出的潛在中藥進行分類。1）補益藥：人參、熟地黃、蜂蜜。2）活血化瘀通絡藥：白果、西紅花、銀杏葉、姜黃、郁金、肉桂、紫堇。3）清熱祛濕，化痰開竅藥：黃連、遠志、積雪草、玉米須，各方藥互相配伍，起化腦絡瘀阻，調氣血通暢，補正氣虛損，調脾胃運化功能，固護腎氣根本。實驗研究表明人參的主要有效成分人參皂苷能干預糖脂代謝紊亂、抑制炎癥反應和IR，通過胰島素信號通路改善海馬區Aβ的異常堆積，延緩認知障礙進展[32]。小檗堿作為黃連的有效成分，不僅可以通過下調晚期糖基化終末產物/晚期糖基化終末產物受體/核因子κB炎癥信號通路，減少神經炎癥反應，保護神經元，保護認知缺陷[33];還可調節高脂高糖引起的腸道菌群紊亂，改善IR，對機體內的長期高血糖環境起到緩解作用[34]。銀杏葉提取物可減弱Aβ的異常沉積和tau蛋白的異常磷酸化，激活海馬區星形膠質細胞自噬，降低腫瘤壞死因子、白細胞介素-1β等炎癥介質的產生[35]。白果有效成分白果內酯對海馬神經元的增殖與突觸產生起到正向保護作用[36]。

本研究運用生物信息學方法對數據集GSE161355表達譜芯片進行處理與分析，結果表明DE的發生可能與神經元突觸傳導、胰島素抵抗、細胞增殖、凋亡、炎癥反應的相關機制關聯，這些潛在靶點可能是干預DE進展的重要因素;預測的中藥及其活性成分可作為治療DE的新藥物。但是研究仍有存在基因表達譜芯片的樣本量有限、樣本質量不均一、分析存在偏倚誤差等不足，預測中藥對DE的治療效果還有待后續的臨床及基礎實驗加以驗證。

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（2021-04-13收稿 本文編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學基金項目（81973796）——“糖脂清”調控lncRNA-PVT1介導miR-106b/ATG16L/LC3通路改善糖尿病認知障礙的作用機制研究作者簡介：石崯力（1995.11—），女，碩士，醫師，研究方向：內分泌與代謝疾病方向，E-mail：viviennne@foxmail.com通信作者：王旭（1960.10—），女，博士，教授，主任醫師，博士研究生導師，研究方向：內分泌與代謝疾病方向，E-mail：njzywangxu@126.com75F30330-E95D-4C6C-AB27-FB800CFFDFFD