鼻咽癌細胞條件培養基誘導THP-1源巨噬細胞向M2型極化*

姚小暄，楊雨嘉，霍慧敏，江 川，崔 昆，黃中恒，唐錦平，韋正波△，謝 瑩,3△

（1.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，南寧 530021；2.廣西醫科大學生命科學研究院，南寧 530021；3.區域性高發腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室，南寧 530021）

鼻咽癌是一種與Epstein-Barr 病毒感染密切相關的頭頸部常見惡性腫瘤，具有獨特的地區分布，在東亞、東南亞、北非和東非，特別是中國南方等地區明顯高發[1]。從鼻咽癌的組織學檢測及單細胞測序中發現，癌細胞周圍有大量免疫細胞浸潤，提示免疫失調在鼻咽癌的發生、發展過程中發揮重要的作用[2-4]。腫瘤微環境中浸潤的巨噬細胞，稱為腫瘤相關巨噬細胞（TAM），來源于腹腔巨噬細胞、表皮朗格漢斯細胞、卵黃囊前體、骨髓造血干細胞等，在微環境中各種信號因子的調節下極化成不同表型的巨噬細胞，通常分為經典活化型（M1-TAM）和交替活化型（M2-TAM）兩種功能亞型[5]。分泌至腫瘤微環境中的干擾素（IFN）-γ、脂多糖（LPS）以及粒細胞集落刺激因子（M-CSF）等，通過不同途徑激活巨噬細胞向M1-TAM型極化。M1型細胞分泌腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-12、IL-6 和IL-1β等促炎因子，并將腫瘤抗原呈遞給T淋巴細胞，啟動CD4+Th1依賴的免疫反應殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤的侵襲、轉移，促進機體的免疫應答[6-7]。而腫瘤微環境中，CD4+T細胞分泌的IL-4、調節性T細胞分泌的IL-10、Th2 型細胞分泌的IL-13 以及B 細胞分泌的免疫球蛋白等，使招募的巨噬細胞向M2-TAM型極化[8]。M2-TAM分泌轉化生長因子（TGF）-β1、IL-10、血管內皮生長因子（VEGF）、活性氧類（ROS）、前列腺素E2（PGE2）、趨化因子配體18（CCL-18）等，形成免疫抑制微環境，誘導新生血管和淋巴管形成，促進腫瘤侵襲、轉移[9]。本研究擬探索基于人單核細胞白血病THP-1 細胞的體外巨噬細胞極化模型，同時探討鼻咽癌細胞系（5-8F、HONE1）培養上清液對THP-1來源巨噬細胞極化方向的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞 人THP-1細胞（Procell CL-0233）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。人鼻咽癌低分化鱗狀細胞株5-8F和HONE1購于湖南湘雅中心實驗室細胞庫，由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 RPMI-1640培養基、DMEM完全培養基購于美國Gibco 公司；流式抗體PerCP-Cyanine5.5 anti-Human CD14、FITC anti-Human CD68、PE anti-Human CD86、Alexa Fluor 647 anti-Human CD163、APC anti-Human CD206 均購自美國Thermo Fisher 公司；引物由AuGCT DNA-SYN Biotechnology Synthesis Lab 提供；佛波酯（PMA）和LPS 購于Sigma-Aldrich 公司；重組人IL-13、IL-4、IFN-γ 均購于PeproTech公司。

1.3 THP-1-M0 巨噬細胞分化 將THP-1 細胞按1×106～2×106個/mL 密度接種于完全培養基中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養，每2～3 d 換液。分別用50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L PMA 刺激THP-1 細胞48 h，誘導轉化為M0型巨噬細胞，每組設置3個復孔，倒置相差顯微鏡下觀察THP-1細胞形態，篩選PMA的最佳刺激濃度。

1.4 細胞因子誘導THP-1-M0 向M1 型和M2 型極化 PMA刺激后，用RPMI-1640完全培養基培養細胞24 h，加入10 pg/mL LPS 和20 ng/mL IFN-γ 處理72 h，使M0 向類M1 型細胞方向極化，得到THP-1-M1；加 入20 ng/mL IL-4 和20 ng/mL IL-13處理THP-1-M0 使其向類M2 型方向極化，得到THP-1-M2。

1.5 鼻咽癌細胞條件培養基對THP-1源M0型巨噬細胞極化的影響 取對數生長期的鼻咽癌細胞5-8F 和HONE1 以適當密度接種于T25 細胞培養瓶中，待細胞完全貼壁后，換新鮮的完全培養基繼續培養48 h，細胞匯合度達到80%時收集培養上清液，用0.22 μm 孔徑的細胞濾器過濾細胞碎片，4 ℃、3 000 r/min 離心5 min，取上清。按1∶1 體積比加入新鮮完全培養基，分別配置5-8F 和HONE1 細胞的條件培養基，加入THP-1 源M0 細胞中，處理48 h，以不作處理的M0 細胞作為陰性對照組，實驗組為5-8F-M0及HONE1-M0。用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測多個標記物表達，分析THP-1來源的巨噬細胞極化方向。

1.6 流式細胞術檢測巨噬細胞CD14、CD68、CD86、CD163、CD206表達 胞外流式抗體的檢測：PBS沖洗，消化細胞，25 ℃、1 000 r/min 離心5 min，棄上清，用細胞染色緩沖液重懸細胞，制成終濃度為1×106～10×106個/mL 的細胞懸液，加入抗體，室溫避光孵育30 min，染色緩沖液洗滌、重懸細胞，過濾后上機檢測。

胞內流式抗體的檢測：制備單細胞懸液后，固定液和破膜緩沖液固定細胞破膜30～90 min，破膜液洗滌，加入蛋白抗體，室溫避光孵育30 min，破膜液洗滌，細胞染色緩沖液重懸，過濾細胞后上機，分別檢測CD14、CD68、CD86、CD163和CD206陽性細胞比例。

1.7 RT-qPCR法檢測IL-6、IL-10、TGF-β1和TNF-α表達 用Trizol 裂解細胞，提取細胞總RNA，Nanodrop分光光度儀檢測RNA的濃度和純度，逆轉錄為cDNA，以GAPDH為內參，用QuantStudioTM6 Real time-PCR 儀進行PCR 擴增，采用2-ΔΔCT法計算IL-6、IL-10、TGF-β1和TNF-α基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.8 統計學方法 用GraphPad Prism 8軟件統計數據及作圖，計量資料以均數±標準差（）表示，經方差齊性檢驗后，若滿員方差齊，則兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。流式數據采用FlowJo_V10分析。

2 結果

2.1 PMA 濃度對THP-1 細胞貼壁情況和細胞形態的影響 用50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L PMA刺激THP-1細胞后，多數呈圓形透亮、大小均一的懸浮細胞，逐漸貼壁，細胞形態近似分為3 種：長梭形且突起明顯的細胞、中心稍暗的近圓形細胞、不規則多觸角形細胞；100 nmol/L PMA 刺激的已貼壁THP-1細胞的形態變化明顯，細胞體積增大，部分細胞伸出多個偽足和突起，核碎裂、核空泡細胞數目少于200 nmol/L 組，見圖1。因此，后續實驗選擇100 nmol/L作為PMA的最佳刺激濃度。

圖1 THP-1細胞形態圖

2.2 巨噬細胞相關標記物的表達 與THP-1 組比較，THP-1-M0 組CD68、CD86 表達升高（均P＜0.05），THP-1-M1 組CD68、CD86、CD163 表達升高（均P＜0.05），THP-1-M2 組CD14 表達降低（P＜0.05），CD68、CD86、CD163 和CD206 表達升高（均P＜0.05），見圖2、表2。

表2 巨噬細胞表面標記物的表達情況，n=3

表2 巨噬細胞表面標記物的表達情況，n=3

與THP-1組比較，*P＜0.05。

圖2 CD14、CD68、CD86、CD163和CD206在不同巨噬細胞亞型中的表達

2.3 M1 型和M2 型巨噬細胞標志基因的表達 與THP-1 組比較，THP-1-M0 組IL-10、TGF-β1表達上調（均P＜0.05），THP-1-M1 組IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1表達上調（均P＜0.05），THP-1-M2組IL-10、TGF-β1表達上調（均P＜0.05），見表3。

表3 M1型和M2型巨噬細胞標志基因的表達，n=3

表3 M1型和M2型巨噬細胞標志基因的表達，n=3

與THP-1組比較，*P＜0.05。

2.4 鼻咽癌細胞條件培養基對THP-1源M0細胞極化方向的影響 與M0 組比較，5-8F-M0 組、HONE1-M0組TNF-α、TGF-β1表達降低，IL-10表達升高，HONE1-M0組IL-6表達升高（均P＜0.05），見表4。

表4 鼻咽癌細胞條件培養基處理后的THP-1-M0基因表達水平，n=3

表4 鼻咽癌細胞條件培養基處理后的THP-1-M0基因表達水平，n=3

與M0組比較，*P＜0.05。

3 討論

巨噬細胞在腫瘤免疫治療中起著重要的作用，但人源巨噬細胞多用作體外的原代培養，難以長期生存、大量傳代。因此，體外建立活化的巨噬細胞模型對于巨噬細胞各亞型的功能研究有重要意義。人源THP-1 細胞系作為體外巨噬細胞誘導模型之一，常用來研究炎癥相關巨噬細胞亞型的功能，THP-1 細胞在形態學和分化特征上與原代巨噬細胞相似，低密度的PMA 即可誘導其貼壁分化[10]。以THP-1 細胞作為研究單核巨噬細胞極化模型的另一優勢為，THP-1細胞遺傳同質性高，可在體外傳代培養幾十代的同時維持細胞活力，細胞間的變異程度低[11]。本課題組采用THP-1細胞來源的巨噬細胞體外誘導模型，是誘導巨噬細胞極化的良好模型。

巨噬細胞被招募到腫瘤微環境后，具有極強的異質性和可塑性，其免疫學特征常根據微環境中釋放的細胞因子而改變[12]。TAMs 主要分為M1 型和M2 型，當組織或器官受到病原體感染時，M1 型巨噬細胞介導Th1型免疫反應，釋放TNF-α、IL-1β、IL-12等促炎因子，激活T細胞，產生Th1型細胞毒性反應，還可在LPS 和IFN-γ 的刺激下高表達CD68、CD86等共刺激分子，并產生IL-6等MHCⅡ類分子，參與炎癥反應和外來病原體的清除，抑制腫瘤的進展。另一種類型為粒細胞或Th2 型細胞分泌的IL-4、IL-13 刺激而成的CD163+、CD206+M2 型巨噬細胞，高表達IL-10、TGF-β、VEGF、MMP9、TGFB1 和PLA2G7等細胞因子，抑制炎癥的進展，促進組織修復、重塑血管生成[13-16]。本課題組構建的體外巨噬細胞模型采用相對特異性標記物CD163、CD206 對THP-1-M2進行標記，兩種表面蛋白在IL-4和IL-13的作用下均升高；另一方面，THP-1-M0組中單核巨噬細胞標記蛋白CD68、CD86 表達量在加入LPS 和IFN-γ孵育后均升高，表明成功將M0型巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞。

在探討鼻咽癌細胞條件培養基對巨噬細胞極化方向的影響時，以本課題組建立的巨噬細胞體外模型為基礎，向THP-1-M0 組中分別加入5-8F 條件培養基和HONE1條件培養基，結果顯示，5-8F條件培養基誘導的M0 型巨噬細胞，促炎基因TNF-α表達下調，抑炎基因IL-10上調，表明5-8F條件培養基主要刺激M0 型巨噬細胞向M2 表型極化；而HONE1細胞條件培養基誘導M0細胞后IL-6、IL-10同時升高，提示可刺激部分M1 型巨噬細胞產生。5-8F-M0 和HONE1-M0 這兩組中TGF-β1表達均降低，可能是因為TGF-β家族主要介導腫瘤細胞的免疫抑制功能，當加入腫瘤細胞條件培養基后，巨噬細胞各亞型的免疫功能均受到限制。基于兩種鼻咽癌細胞條件培養基誘導M0 極化方向的差異結果，本課題組考慮可能與細胞的生物學特性相關。5-8F細胞是從SUNE-1鼻咽癌細胞株體外優化篩選出的具有高淋巴結轉移潛能的鼻咽癌低分化鱗狀細胞癌亞株，高淋巴結轉移潛能是否與其對周圍環境中巨噬細胞的M2 型極化作用相關，有待于進一步研究。