CD38和p90RSK/CREB/Bcl-2信號通路在丙泊酚預處理星形膠質細胞減輕谷氨酸神經毒性中的作用*

肖 飛，李春來,2，覃銀瑩，陳 靜，關睿聰，謝玉波,2，鐘 妤

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院麻醉科，南寧 530021；2.廣西消化道腫瘤加速康復外科基礎研究重點實驗室，南寧 530021）

谷氨酸是體內一種重要的神經遞質，能夠維持大腦活動的興奮性，與神經元和膠質細胞的增殖、發育、存活及死亡密切相關，但其在體內濃度過高時可產生興奮性神經毒性[1]。有研究表明谷氨酸的神經毒性與多種腦損傷的發生、發展密切相關[2]。人白細胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）38是哺乳動物體內最主要的一種二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）核糖基環化酶，可以催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）向環腺苷二磷酸核糖（cyclic ADP-ribose，cADPR）轉化，cADPR作為第二信使在細胞之間的信號轉導中起重要作用[3-4]。p90RSK/CREB/Bcl-2信號通路，具有促進細胞存活和炎癥修復的作用，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）可以激活p90RSK，后者激活環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）并誘導B 細胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）的產生[5]。本課題組前期的研究發現，谷氨酸可能通過抑制p90RSK/Bcl-2信號通路產生神經毒性[6]，谷氨酸是否通過p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路產生神經毒性，目前尚不清楚。有研究報道丙泊酚可以通過降低興奮性神經遞質的濃度從而產生腦保護作用[7]。丙泊酚減輕谷氨酸神經毒性的具體機制尚不清楚。本研究擬通過丙泊酚預處理星形膠質細胞，并用其培養基孵育大鼠嗜鉻細胞瘤（PC12）細胞系，進一步探討谷氨酸神經毒性的作用機制并尋找有效的抗谷氨酸神經毒性的藥物，為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 丙泊酚（批號：10KC3900，Corden Pharma 公司，意大利）；兔抗大鼠p90RSK 單克隆抗體、p-CREB 單克隆抗體、Bcl-2 單克隆抗體和β-Tubulin 單克隆抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；山羊抗兔HR-IgG（Santa Cruz 公司，美國）；Annexin V-PI 凋亡檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，中國）；ATP、ROS 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，中國）；CD38-siRNA（生工生物工程股份有限公司，中國）；轉染試劑（上海徠創生物科技有限公司，中國）；PC12 細胞系（國家實驗細胞資源共享服務平臺，中國）。

1.2 實驗分組及處理 按照隨機數字表法將PC12細胞分為4組：對照組（C組）、谷氨酸組（G組）、丙泊酚預處理組（PG 組）、CD38 基因沉默組（CPG 組）。C 組即為正常培養的PC12 細胞；G 組用3.5 mmol/L谷氨酸孵育PC12細胞6 h；PG組先用100 μmol/L丙泊酚預處理星型膠質細胞6 h，并將其培養基加入谷氨酸干預PC12細胞中；CPG組先用CD38-siRNA沉默星形膠質細胞CD38 基因，再用100 μmol/L 丙泊酚預處理星型膠質細胞6 h，并將其培養基加入谷氨酸干預PC12細胞中（同PG組）。

1.3 分離和提取星形膠質細胞 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性SD 大鼠，1 日齡，體重5～7 g，超凈工作臺中斷頭取腦，取出雙側大腦皮質，除去腦膜和血管，用眼科鑷將其剪成1 mm3大小的組織塊，通過胰蛋白酶和膠原酶消化成為單細胞懸液，即為星形膠質細胞懸液（所有操作均在冰上進行）。將細胞轉移到含有10%胎牛血清+89%的DMEM-F12+1%青鏈霉素的培養皿中，在37 ℃，5%CO2溫箱中培養。

1.4 siRNA轉染CD38并篩選出最適濃度 將序列為5’-CUCAAACCAUACCAUGUAA-3’的siRNA與轉染試劑按照說明書混合后，加入細胞培養皿，并輕輕混勻，24 h 后更換培養基，轉染48 h 后檢測CD38mRNA 或CD38 蛋白表達，并選出CD38-siRNA 的最適轉染濃度。轉染成功后，取統一轉染條件的星形膠質細胞備用。

1.5 ROS試劑盒測定各組ROS的含量 各組PC12細胞用相應的藥物處理后，按照ROS試劑盒操作說明進行后，使用熒光酶標儀檢測各組細胞的熒光強弱（激發波長設置為488 nm，發射波長設置為525 nm）。

1.6 ATP 試劑盒測定各組ATP 的含量 各組PC12細胞用相應的藥物處理后，按照ATP試劑盒操作說明進行后，使用化學發光儀檢測各組相對光子強度（relative light unit，RLU）。

1.7 蛋白質免疫印跡（Western blotting）法測定PC12 細胞p90RSK、p-CREB 和Bcl-2 蛋白的表達各組PC12 細胞用相應的藥物處理后，加入適量細胞裂解液（RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑=98∶1∶1）提取總蛋白，采用BCA 法進行蛋白定量，并與上樣緩沖液混勻、煮沸。各組取適量蛋白加入SDS-PAGE凝膠中進行電泳，轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。TBST 漂洗3 次，每次5 min，分別加入兔抗大鼠p90RSK 單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗大鼠p-CREB單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體（1∶1 000）或β-Tubulin（1∶5 000），4 ℃搖床孵育過夜。TBST漂洗3次，每次5 min，加入羊抗兔HR-IgG 抗體（1∶5 000），常溫搖床孵育1 h。使用Odyssey（LI-COR 公司，美國）掃膜儀掃膜，應用Image Lab軟件進行分析灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與或β-Tubulin 條帶灰度值的比值反映目的蛋白表達水平。

1.8 流式細胞術檢測各組PC12細胞凋亡情況 按照Annexin V-PI 細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行：加入適量Binding Buffer、重懸細胞、FITC Annexin V與PI 混勻、室溫下避光反應5～15 min 后待上機檢測。

1.9 統計學方法 采用SPSS 20.0 軟件進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞ROS含量的變化 與C組比較，G組細胞ROS 含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與G組比較，PG組細胞ROS含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與PG 組比較，CPG 組細胞ROS含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組ROS含量的變化

2.2 各組細胞ATP含量的變化 與C組比較，G組細胞ATP 含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與G 組比較，PG 組細胞ATP 含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與PG組比較，CPG組細胞ATP含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組ATP含量的變化

2.3 各組p90RSK 蛋白、p-CREB 蛋白和Bcl-2 蛋白表達的變化 與C 組比較，G 組p90RSK 蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白表達下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與G 組比較，PG 組p90RSK 蛋白、p-CREB 蛋白和Bcl-2 蛋白表達上調，差異有統計學意義（均P＜0.05）；與PG 組比較，CPG 組p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白表達下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖3。

圖3 Western blotting檢測各組p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白水平比較

2.4 各組PC12 細胞凋亡情況 與C 組比較，G 組細胞凋亡率升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與G 組比較，PG 組細胞凋亡率降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與PG 組比較，CPG 組細胞凋亡率升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組PC12細胞凋亡率比較

3 討論

谷氨酸是體內一種重要的興奮性神經遞質[1]，在中樞神經系統的發育過程中起著至關重要的作用[8]。當體內谷氨酸大量釋放和堆積時，可產生興奮性神經毒性，造成神經細胞壞死或凋亡[9]。丙泊酚是一種起效快，持續輸注無蓄積的靜脈麻醉藥。本課題組前期研究發現丙泊酚可降低興奮性神經遞質的濃度，減輕谷氨酸的神經毒性，產生腦保護作用[6]。本研究通過應用丙泊酚及沉默CD38基因，發現丙泊酚減輕谷氨酸的神經毒性可能與CD38和p90RSK/CREB/Bcl-2信號通路有關。

p90RSK/CREB/Bcl2 信號通路在神經元的分化、發育、生存和凋亡等生理過程中發揮重要作用[5]。本實驗結果顯示，當給予谷氨酸時，PC12細胞的ATP含量、p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白表達降低，ROS含量及細胞凋亡率上升。當加入丙泊酚預處理星形膠質細胞的培養基時，ATP含量、p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2蛋白表達上升，ROS 含量和細胞凋亡率降低。提示谷氨酸可能通過抑制p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路產生神經毒性，丙泊酚可能通過激活p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路，減輕谷氨酸的神經毒性。

CD38 是一種ADP 核糖基環化酶，神經系統內主要存在于星形膠質細胞的細胞膜，可以催化胞外氧化NAD+向細胞內cADPR 轉化，導致Ca2+從內質網釋放到細胞質，觸發F-肌動蛋白的構象改變，細胞骨架重塑，促進質膜的內陷及外凸作用[10-12]，而細胞質膜的內陷及外凸作用與細胞的胞吞胞吐有關。本研究結果顯示，當沉默CD38基因后，再將丙泊酚處理星形膠質細胞的培養基加入谷氨酸干預PC12細胞中，ATP含量、p90RSK蛋白、p-CREB蛋白和Bcl-2 蛋白表達降低，ROS 含量及凋亡率升高。說明CD38蛋白在丙泊酚預處理星形膠質細胞減輕谷氨酸的神經毒性中發揮重要作用。

本課題組前期研究表明丙泊酚可以激活星形膠質細胞膜上的CD38蛋白，從而使內質網內的Ca2+釋放到細胞質。有研究發現星型膠質細胞可以釋放功能性線粒體至神經元，從而修復受損的神經元[13]，而星型膠質細胞釋放線粒體由Ca2+依賴的CD38/cADPR信號通路介導[14-15]。由此推測：丙泊酚預處理星形膠質細胞減輕谷氨酸的神經毒性可能是通過激活星形膠質細胞膜上的CD38 蛋白，導致星形膠質細胞內的鈣大量釋放到細胞質，觸發F-肌動蛋白的構象改變，細胞骨架重塑，促進質膜的外凸作用，從而釋放功能性線粒體至神經元，激活p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路，修復受損的神經元，減輕谷氨酸的神經毒性。

綜上所述，谷氨酸的神經毒性可能和p90RSK/CREB/Bcl-2信號通路有關，而丙泊酚可能通過激活星形膠質細胞膜上的CD38 蛋白，激活p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路，修復受損的神經元，從而減輕谷氨酸的神經毒性。而星形膠質細胞是否通過釋放功能性線粒體來激活p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路，仍需進一步實驗驗證。