糞便SDC2基因甲基化檢測在結直腸癌輔助診斷中的價值

龔志贇，江銘磊，施衛忠，盧仁泉，郭 林

（復旦大學附屬腫瘤醫院檢驗科 復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032）

2020年中國癌癥統計數據顯示，在我國全部惡性腫瘤中，結直腸癌的發病率居第2位，病死率居第5位，新發病例55.5萬，死亡病例28.6萬[1]。大部分結直腸癌患者被確診時已處于中晚期，療效及預后均較差。早期篩查、早期診斷并進行適當干預能將結直腸癌患者的存活率提高至75%～90%[2-3]。目前，腸鏡活檢是腸癌早期診斷常用的方法，也是“金標準”方法，但有一定漏檢率，并且這是一種侵入性的檢查，有腸穿孔、出血、感染等風險。糞便隱血試驗（fecal immunochemical test，FIT）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）檢測是除腸鏡外常用的結直腸癌篩查方法，但FIT易受干擾，假陽性率高[4]；CEA、CA19-9特異性低，一般用于療效監測[5]。因此，尋找一種高敏感性、高特異性的非侵入性結直腸癌篩查和診斷方法顯得尤為重要。結直腸癌早期會發生異常甲基化，相關甲基化標志物陸續被報道，有研究結果顯示，黏結蛋白聚糖2（syndecan 2，SDC2）參與腫瘤細胞活化、腫瘤血管生成及侵襲、轉移[6]。本研究擬探討SDC2基因甲基化、CEA、CA19-9在結直腸癌中的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年5月—2021年10月復旦大學附屬腫瘤醫院確診的結直腸癌患者51例（結直腸癌組），其中男25例、女26例，年齡40～75歲。結直腸癌診斷標準參照《中國結直腸癌診療規范（2020年版）》[7]，TNM分期參照美國癌癥聯合委員會結直腸癌TNM分期標準[8]。選取同期復旦大學附屬腫瘤醫院確診的結直腸腺瘤患者22例（腺瘤組），其中男12例、女10例，年齡40～60歲。結直腸腺瘤診斷標準參考《中國早期結直腸癌篩查及內鏡診治指南（2014年，北京）》[9]。另選取同期復旦大學附屬腫瘤醫院健康體檢者39名作為正常對照組，其中男19名、女10名，年齡35～60歲，腸鏡結果均無明顯異常。本研究經復旦大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準，所有對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標準

1.2.1 納入標準 初診患者，有明確的病理診斷，腸鏡檢查前有SDC2基因甲基化、CEA、CA19-9的檢測結果。

1.2.2 排除標準 合并其他腫瘤的患者，進行過放化療及全身治療的患者，妊娠期女性，病理診斷不明確的患者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理 收集所有患者治療前及正常對照者體檢當日糞便樣本，采用糞便采集裝置（廣州康立明生物科技股份有限公司）采集4.5 g糞便，放入配套的糞便保護液中，用于后續檢測。在收集糞便樣本的同時采集所有對象的靜脈血4 mL，4 h內離心分離血清，-20 ℃保存，2周內完成血清CEA、CA19-9檢測。

1.3.2 P12全自動樣本預處理儀與手工法的比對 隨機選取26份結直腸癌患者、結直腸腺瘤患者和正常對照者的糞便樣本，每份樣本均分為2份，1份采用P12全自動樣本預處理儀進行預處理，1份采用手工法預處理，分別檢測。采用2-ΔCt法計算26例比對樣本的糞便SDC2基因相對表達量，ΔCt=CtSDC2-Ctβ-actin。比較2種處理方法檢測結果的一致性。

1.3.3 糞便SDC2基因甲基化檢測 采用熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測SDC2基因甲基化，試劑盒（批號：CSD12210603）購自廣州康立明生物科技股份有限公司，檢測儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。嚴格按儀器和試劑說明書操作。

1.3.4 血清CEA、CA19-9水平檢測 采用cobas e 801全自動電化學發光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑檢測血清CEA、CA19-9水平。嚴格按儀器和試劑說明書操作。

1.3.5 陽性標準 糞便SDC2基因甲基化以循環閾值（cycle threshold，Ct）≤38為陽性，CEA和CA19-9均以高于參考區間上限（5.2 ng/mL、29 U/mL）為陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。呈非正態分布的計量資料以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用Kruskal Wallis H檢驗，兩兩比較采用Mann Whitney U檢驗。計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用二元 Logistic回歸分析建立各項指標的聯合檢測方程，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價各項指標單項檢測及聯合檢測診斷結直腸癌的效能。采用Peason相關分析評估2種方法之間的相關性，采用kappa檢驗分析2種方法的一致性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組、腺瘤組及正常對照組各項指標陽性率比較

結直腸癌組糞便SDC2基因甲基化陽性率顯著高于腺瘤組和正常對照組（P＜0.01）。結腸癌組糞便SDC2基因甲基化陽性率顯著高于血清CEA和CA19-9的陽性率（P＜0.01）。見表1。

結直腸癌Ⅰ～Ⅳ期患者之間糞便SDC2基因甲基化陽性率差異均無統計學意義（P＞0.05）。結直腸癌Ⅰ～Ⅲ期患者的糞便SDC2基因甲基化陽性率顯著高于血清CEA和CA19-9的陽性率（P＜0.01）。見表1。

表1 結直腸癌組、腺瘤組及正常對照組各項指標陽性率比較 例（%）

2.2 糞便SDC2基因甲基化、血清CEA、CA19-9單項和聯合檢測診斷結直腸癌的效能

糞便S D C 2基因甲基化及血清C E A和CA19-9的聯合檢測方程為：Logit（P）=1.02×SDC2+0.14×CEA+0.01×CA19-9。ROC曲線分析結果顯示，糞便SDC2基因甲基化、血清CEA、CA19-9單項檢測和聯合檢測診斷結直腸癌的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.965、0.694、0.567、0.976。見圖1、表2。

表2 糞便SDC2基因甲基化、血清CEA、CA19-9單項及聯合檢測診斷結直腸癌的ROC曲線參數

圖1 糞便SDC2基因甲基化、血清CEA、CA19-9單項及聯合檢測診斷結直腸癌的ROC曲線

2.3 結直腸癌組糞便SDC2基因甲基化與血清CEA聯合檢測的陽性率分析

將腺瘤組和正常對照組合并為對照組（61例），糞便SDC2基因甲基化和血清CEA聯合檢測可將結直腸癌組的陽性率從84.3%（糞便SDC2基因甲基化單項檢測）提升至90.2%（糞便SDC2基因甲基化+CEA），顯著高于CEA的陽性率（P＜0.01）。見表3。

表3 結直腸癌組與對照組血清CEA水平及糞便SDC2基因甲化、血清CEA單項和聯合檢測陽性率比較

2.4 P12自動化樣本預處理儀與手工法預處理樣本糞便SDC2基因相對表達量比較

分別采用P12自動化樣本預處理儀與手工法同時對26份糞便樣本進行預處理。2種方法糞便SDC2基因相對表達量呈正相關（r=0.994，P＜0.001），一致性良好（kappa=0.845，P＜0.001）。見圖2。

圖2 P12自動化樣本預處理儀與手工法預處理樣本SDC2基因相對表達量的相關性

3 討論

基因甲基化檢測是目前臨床應用前景較廣的腫瘤篩查方法，在發達國家已開展多年[10]。目前，采用腸鏡取樣進行組織病理學檢查依然是診斷結直腸癌的金標準，但其缺點也很明顯，特別是侵入性操作會導致較多結直腸癌患者無法堅持定期檢查，錯失了早期診斷時機，降低了結直腸癌患者的生存率[11]。臨床上常用的非侵入性檢查項目為血清CEA、CA19-9，但兩者的敏感性和特異性不高，更適用于結直腸癌患者的療效監測[12]。因此，臨床亟需一種無創且敏感性和特異性均較高的方法來篩查、診斷結直腸癌，特別是早期結直腸癌[13-14]。為此，本研究探討了糞便SDC2基因甲基化在結直腸癌輔助診斷中的價值。

SDC2屬于轉化生長因子β通路相關基因，其與免疫監控及細胞增殖、侵襲、轉移等密切相關；在結直腸癌中，SDC2主要調節細胞與腫瘤微環境的相互作用，使基質金屬蛋白酶活化，分解細胞外基質，同時還參與了間質-上皮轉化過程等生物學進程，促進腫瘤細胞的增殖和轉移[15-16]。有研究發現，SDC2基因甲基化與結直腸癌關系密切，有良好的應用前景[17]。本研究結果顯示，糞便SDC2基因甲基化診斷結直腸癌的AUC為0.965，最佳臨界值（Ct值）為-38.1，敏感性為88.2%，敏感性顯著優于目前臨床常用指標（CEA和CA19-9）。提示將糞便SDC2基因甲基化用于結直腸癌篩查具有良好的應用前景。本研究結果還顯示，結直腸癌Ⅰ～Ⅳ期患者糞便SDC2基因甲基化的陽性率分別為70%、85%、90%、94%，各分期間差異均無統計學意義（P＞0.05）；結直腸癌Ⅰ～Ⅲ期患者糞便SDC2基因甲基化陽性率顯著高于血清CEA和CA19-9的陽性率（P＜0.01）。提示糞便SDC2基因甲基化檢測在早期結直腸癌的篩查中有較好的應用價值。這可能與SDC2參與了腫瘤的生長、浸潤、轉移有關。另外，糞便SDC2基因甲基化聯合CEA檢測可將陽性率提升至90.2%，有效提升了結直腸癌的檢出率。

為了提升糞便SDC2基因甲基化的檢測效率，本研究對P12自動化樣本預處理儀與手工法預處理樣本的效果進行了比對，結果顯示2種方法預處理樣本的檢測結果呈正相關（r=0.994，P＜0.001），一致性良好（kappa=0.845，P＜0.001）。提示自動化樣本預處理可以取代人工預處理，在樣本量較大的情況下，采用自動化儀器預處理樣本更快速，且更加規范，不宜出錯和污染，有助于提升檢測效率。

本研究的不足之處在于樣本量較小，這可能與用于SDC2基因甲基化檢測的糞便樣本留取方式與一般糞常規不同，患者尚需要一個接受過程有關。相信隨著更廣泛的宣傳和患者接受度的提高，糞便SDC2基因甲基化檢測無創、簡便、準確的優勢將會進一步體現。

綜上所述，糞便SDC2基因甲基化具有較高的敏感性，可用于結直腸癌的輔助診斷，在早期結直腸癌的篩查中也有較高的臨床價值，具有良好的臨床應用前景。