結(jié)直腸癌患者SorCS1基因啟動(dòng)子甲基化檢測的臨床價(jià)值

劉 凱，張沛茹，謝素紅，郭 林，盧仁泉

（復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤系，上海 200032）

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)的發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第3位，病死率居第2位[1]。近年來，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢[2]。有研究結(jié)果顯示，一些基因的DNA甲基化與結(jié)直腸癌的發(fā)展密切相關(guān)[3]。DNA甲基化對(duì)于基因的表達(dá)有重要的調(diào)節(jié)作用[4]，如某些抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化會(huì)降低轉(zhuǎn)錄活性，使抑癌基因表達(dá)沉默，導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常而發(fā)生惡性腫瘤。SEPT9基因是 GTP結(jié)合蛋白家族成員，參與了細(xì)胞骨架的形成、細(xì)胞分裂和腫瘤的發(fā)生等，其基因啟動(dòng)子的高甲基化與結(jié)直腸癌密切相關(guān)。本研究擬通過定量檢測結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織基因啟動(dòng)子甲基化水平，并與腫瘤基因圖譜計(jì)劃（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，篩選出結(jié)直腸癌患者差異表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化水平升高的基因，并探討其與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年9—11月復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科就診的17例結(jié)直腸癌患者，其中男9例、女8例，年齡30～74歲。參考美國癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行結(jié)直腸癌TNM分期。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)術(shù)后或活檢后病理確診為結(jié)直腸癌；年齡＞18歲。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）處于妊娠期或哺乳期的女性；（2）既往有惡性腫瘤病史；（3）既往有腹部外科手術(shù)史；（4）術(shù)前已行放射治療或化療等輔助治療；（5）病理學(xué)類型為惡性黑素瘤、間質(zhì)瘤、淋巴瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、鱗癌等非腺癌系惡性腫瘤；（6）原發(fā)灶不在結(jié)直腸的惡性腫瘤患者（卵巢、宮頸、子宮、空腸、回腸、十二指腸或原發(fā)不明惡性腫瘤侵犯結(jié)直腸等）。

1.3 方法

1.3.1 一般資料 收集所有患者的臨床資料。年齡≤60歲7例，＞60歲10例；腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期4例，Ⅲ～Ⅳ期13例；淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移8例，有轉(zhuǎn)移9例；腫瘤部位為直腸10例，結(jié)腸7例；腫瘤直徑（缺失1例）≤5 cm 12例，＞5 cm 4例。

1.3.2 樣本收集 收集術(shù)中切除的癌組織樣本及距腫瘤＞5 cm的癌旁組織樣本，-80 ℃液氮罐保存。

1.3.3 DNA抽提 采用基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，目錄號(hào)：DP304]提取組織DNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.3.4 基因啟動(dòng)子甲基化檢測 采用基于堿基特異性裂解和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）的MassARRAY平臺(tái)（美國Sequenom公司）上的EpiTYPER方法定量檢測基因啟動(dòng)子甲基化，嚴(yán)格按儀器和試劑（內(nèi)附陰、陽性質(zhì)控）說明書進(jìn)行操作。引物由平臺(tái)內(nèi)部程序設(shè)計(jì)并合成。結(jié)果判讀：基因啟動(dòng)子甲基化結(jié)果由儀器直接輸出。癌組織與癌旁組織基因啟動(dòng)子甲基化存在差異的篩選條件：（1）陽性質(zhì)控＞0.7，陰性質(zhì)控＜0.5；（2）依據(jù)廠商提供的資料，癌組織基因啟動(dòng)子甲基化水平均值與癌旁組織的差值應(yīng)≥0.20。用癌組織基因啟動(dòng)子甲基化檢測值-癌旁組織基因啟動(dòng)子甲基化檢測值的差值（Δ）表示結(jié)直腸癌患者癌組織基因啟動(dòng)子甲基化水平相對(duì)于癌旁組織的差異。根據(jù)MassARRAY平臺(tái)的檢測值，以癌組織與癌旁組織的差值≥0.20為陽性。

1.3.5 與TCGA數(shù)據(jù)庫的比對(duì)分析 將篩選出的基因與TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，查詢相關(guān)基因的表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化情況。

1.3.6 SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化，試劑盒（熒光探針法）購自博爾誠（北京）科技有限公司，檢測儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒（內(nèi)附ACTB作為內(nèi)參引物）說明書操作。結(jié)果判讀：SEPT9啟動(dòng)子甲基化水平結(jié)果由循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）計(jì)算而來，計(jì)算公式[6]為：ΔΔCt組織=ΔCt組織-ΔCt內(nèi)參；ΔCt組織=Ct組織ACTB-Ct組織SEPT9；ΔCt參照品=Ct參照品ACTBCt參照品SEPT9；式中參照品為陽性對(duì)照品，ΔΔCt組織為組織基因啟動(dòng)子甲基化水平，2ΔΔCt癌組織-ΔΔCt癌旁組織為癌組織相對(duì)于癌旁組織基因啟動(dòng)子甲基化水平的差異，參考值取5，以2ΔΔCt癌組織-ΔΔCt癌旁組織＞5為SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，2個(gè)配對(duì)組之間比較采用Wilcoxon W符號(hào)秩和檢驗(yàn)，2個(gè)獨(dú)立組之間比較采用 Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織SorCS1基因和CASR基因啟動(dòng)子甲基化水平比較

采用MassARRAY平臺(tái)檢測結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織KHDRBS2、CNTN1、IRF4、ARHGAP20、NDRG4、GFRA1、CPEB1、NPY、CRHR2、SorCS1、PTPRT、CASR基因啟動(dòng)子甲基化水平。癌組織SorCS1基因和CASR基因啟動(dòng)子甲基化水平均顯著高于癌旁組織（P＜0.001），其他基因不符合篩選條件予以剔除。見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織SorCS1基因和CASR基因啟動(dòng)子甲基化水平比較

2.2 與TCGA數(shù)據(jù)庫的比對(duì)結(jié)果

與TCGA數(shù)據(jù)庫的比對(duì)結(jié)果顯示，膀胱尿路上皮癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、直腸腺癌、胃腺癌患者的SorCS1基因相對(duì)表達(dá)量均低于正常對(duì)照者（P＜0.05），結(jié)腸癌、直腸癌、肺腺癌患者SorCS1基因啟動(dòng)子甲基化水平均明顯高于正常對(duì)照者（P＜0.05），見圖2。結(jié)直腸癌患者和正常對(duì)照者CASR基因相對(duì)表達(dá)量均較低（TPM＜1），且兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），TCGA數(shù)據(jù)庫中無CASR基因啟動(dòng)子甲基化的數(shù)據(jù)。

圖2 SorCS1基因啟動(dòng)子甲基化水平分析比較

2.3 癌組織與癌旁組織SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化水平比較

結(jié)直腸癌組織SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化水平均顯著高于癌旁組織（P＜0.001）。見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化水平的比較

2.4 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織SorCS1、CASR、SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化水平差異比較

Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者ΔSorCS1基因和SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化水平分別高于Ⅰ～Ⅱ期患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），而不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑的患者之間ΔSorCS1基因和SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者之間ΔCASR基因差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者之間SorCS1基因、CASR基因、SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化水平比較

續(xù)表2

2.5 結(jié)直腸癌患者癌組織SorCS1基因與SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化陽性率比較

SorCS1基因啟動(dòng)子甲基化陽性率為82.35%（14/17），SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化陽性率為70.58%（12/17），兩者聯(lián)合檢測陽性率為88.24%（15/17）。

3 討論

結(jié)直腸癌是由多基因突變和表觀遺傳改變等致病機(jī)制逐漸積累和相互作用引起的。基因甲基化是目前研究最為深入的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，若局部出現(xiàn)高甲基化，會(huì)導(dǎo)致基因組極不穩(wěn)定，最終誘發(fā)腫瘤。有研究結(jié)果顯示，異常甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)下調(diào)與結(jié)腸組織從良性到惡性病變的病理發(fā)展過程密切相關(guān)[7]。目前，SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化檢測在結(jié)直腸癌的篩查與臨床診療中已被廣泛應(yīng)用[8-9]，而SorCS1基因啟動(dòng)子甲基化與腫瘤的關(guān)系還鮮有報(bào)道。SorCS1是神經(jīng)元受體運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可結(jié)合多種特異性配體完成營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控、中樞系統(tǒng)代謝控制等生理過程[10-11]。SorCS1的表達(dá)水平與阿爾茨海默病[12]、2型糖尿病[13]及慢性腎臟疾病[14]等有關(guān)。

本研究通過MassARRAY平臺(tái)檢測結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織KHDRBS2、CNTN1、IRF4、ARHGAP20、NDRG4、GFRA1、CPEB1、NPY、CRHR2、SorCS1、PTPRT、CASR基因啟動(dòng)子甲基化水平，篩選后發(fā)現(xiàn)癌組織SorCS1基因和CASR基因啟動(dòng)子甲基化水平均顯著高于癌旁組織（P＜0.001）。與TCGA數(shù)據(jù)庫比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，膀胱尿路上皮癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、直腸腺癌、胃腺癌患者的SorCS1基因相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照者（P＜0.05），而在結(jié)腸癌、直腸癌、肺腺癌中SorCS1基因啟動(dòng)子甲基化水平明顯高于正常對(duì)照者（P＜0.05）。提示SorCS1基因啟動(dòng)子甲基化水平的升高可能影響了SorCS1基因的表達(dá)，這與HUANG等[15]SorCS1 mRNA和蛋白表達(dá)的缺失與相應(yīng)啟動(dòng)子甲基化高度相關(guān)（P＜0.001、P=0.033）的研究結(jié)果一致。

SorCS1是VPS10結(jié)構(gòu)域受體家族5個(gè)成員之一，另外4個(gè)成員分別為Sortilin、SorCS2、SorCS3和SorLA。既往研究發(fā)現(xiàn)，VPS10P的受體Sortilin增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的侵襲作用[16]，還可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖[17]。有研究結(jié)果顯示，SorCS2在生存率較低的結(jié)直腸癌患者中表達(dá)上調(diào)[18]，而胃癌患者中SorCS3呈高甲基化[19]。雖然目前尚未完全了解VPS10結(jié)構(gòu)域受體家族的5個(gè)成員在腫瘤中的作用機(jī)制，但結(jié)合相關(guān)研究結(jié)果，推測該家族在腫瘤的發(fā)展中可能具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者SorCS1基因和SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化水平分別高于Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑的患者之間癌組織與癌旁組織SorCS1基因和SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而不同臨床病理特征的結(jié)直腸癌患者之間CASR基因啟動(dòng)子甲基化水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示SorCS1基因可能與結(jié)直腸癌的進(jìn)展有關(guān)。雖然SorCS1在腫瘤中的功能還不明確，但一些SorCS1相關(guān)基因，如STAT3、PDGF-BB、AMPARs和突觸蛋白神經(jīng)素已被證明與腫瘤發(fā)展有關(guān)[20-21]。在對(duì)SorCS1基因下游機(jī)制的研究中，LARSEN等[22]發(fā)現(xiàn)，SorCS1基因表達(dá)的降低減少了HEK-293細(xì)胞中磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3的生成。雖然SorCS1可以抑制某些細(xì)胞中的促癌因子，但還需要更深入的研究來闡明SorCS1在結(jié)直腸癌中的功能和潛在機(jī)制。

本研究結(jié)果還顯示，SorCS1基因啟動(dòng)子甲基化陽性率高于SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化陽性率，與李丹等[23]的Meta分析結(jié)果基本相符，且SorCS1基因聯(lián)合SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化檢測可提高對(duì)結(jié)直腸癌的檢測陽性率。基因啟動(dòng)子甲基化作為輔助分子分期參數(shù)可用于區(qū)分國際抗癌聯(lián)盟（the Union for International Cancer Control，UICC）分期和 TNM分期，與目前所用的TNM分期系統(tǒng)結(jié)合，可有效提高現(xiàn)有治療方案的效率[24]。

本研究的不足之處在于樣本量較小，尚需要多中心大樣本量研究來進(jìn)一步驗(yàn)證SorCS1基因啟動(dòng)子甲基化在結(jié)直腸癌中的作用，并更深入地研究SorCS1影響結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制。

綜上所述，SorCS1基因啟動(dòng)子甲基化檢測在結(jié)直腸癌患者中有較高的陽性率，且可與SEPT9基因啟動(dòng)子甲基化檢測形成互補(bǔ)，或可作為結(jié)直腸癌篩查潛在的分子標(biāo)志物。

致謝：感謝上海吉?jiǎng)P醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司遲連凱博士對(duì)本研究的支持與幫助。