老翹HPLC特征圖譜研究

元昕，王姝君，唐建開，張立偉

（山西大學 分子科學研究所 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

0 引言

連翹為木樨科植物連翹（Forsythia suspensa（Thnub.）Vahl）的干燥果實，主產于山西、陜西、河南、河北等地，具有清熱解毒、消腫散結之功效，主治溫熱、丹毒、斑疹、瘡瘍腫毒、瘰疬等證。根據采收期不同，連翹分為青翹和老翹兩種規格，秋季果實初熟尚帶綠色時采收，除去雜質，蒸熟，曬干，習稱“青翹”；秋季果實熟透時采收，曬干，除去雜質，習稱老翹［1］。連翹主要含有苯乙醇苷類、木脂素類和黃酮類等化學成分［2-5］。現行《中華人民共和國藥典：一部》（2020年版）在連翹項下收載了青翹和老翹兩種規格，并在性狀、鑒別、浸出物、揮發油含量、連翹酯苷A和連翹苷含量等方面做出了規定，但以此來評價連翹飲片的質量尚存在一定程度的不完整性［6-8］。近年來中藥特征圖譜作為中藥質量控制的補充檢測方法，愈來愈受到研究工作者的重視［9-12］，因此，為了比較全面的控制青翹的質量，已有較多的學者對青翹的指紋圖譜或特征圖譜進行了比較充分的研究［13-14］，為進一步完善青翹的鑒別和質量評價提供了依據和方法。目前尚未見到有關老翹特征圖譜的研究報道，從真偽性、準確度把握老翹質量標準會有所不足，為了更好地控制老翹飲片品質，可以利用中藥特征圖譜考察老翹化學成分以及各成分之間的差異，比較科學地控制老翹飲片質量，據此，本文利用高效液相色譜建立老翹特征圖譜，分別指認了梾木苷甲基醚、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素5個特征成分，為進一步完善老翹的鑒別及質量評價提供依據。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀（Agilent 1260 II，美國Agilent公司）；Agilent Zorbax C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；萬分之一天平（OHAUS CP114型，奧豪斯上海儀器公司）；超聲波掃描清洗機（SB-3200 DTS型，寧波新芝生物科技公司）；十萬分之一天平（EX125DZH型，奧豪斯常州儀器公司）。

連翹酯苷 A（98%，批號MUST-20032804，成都曼思特生物科技有限公司），連翹脂素（98%，批號MUST-19061710，成都曼思特生物科技有限公司），連翹苷（99%，批號MUST-19070810，成都曼思特生物科技有限公司），梾木苷甲基醚（96%，江蘇永健醫藥科技有限公司提供），蘆丁（99%，批號：101625，江蘇永健醫藥科技有限公司），色譜純甲醇、乙腈、冰醋酸（美國Fisher公司），其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水。老翹來自藥材市場和山西連翹基地共12批，撿除雜質，篩去種子。經山西大學分子科學研究所張立偉教授鑒定為木樨科連翹屬植物連翹（Forsythia suspensa（Thnub.）Vahl）的成熟干燥果殼。樣品來源信息見表1。

表1 樣品來源Table 1 Origins of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Agilent Zorbax C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.4%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～ 13 min，13%A→16%A；13 min～23 min，16%A；23 min～ 33 min，16%A→21%A；33 min～ 45 min，21%A→28%A；45 min～ 63 min，28%A→45%A），流速0.8 mL·min-1，柱溫25 ℃，進樣量10 μL，檢測波長280 nm。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合對照品溶液

分別精密稱取梾木苷甲基醚、連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素和蘆丁對照品9、15、6、2、4 mg置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液溶解定容至刻度，得到混合標準溶液，其中梾木苷甲基醚濃度為0.9 mg/mL，連翹酯苷A濃度為1.5 mg/mL，連翹苷濃度為0.6 mg/mL，連翹脂素濃度為0.2 mg/mL、蘆丁濃度為0.4 mg/mL。

2.2.2 供試品溶液

準確稱取老翹藥材（過3號篩）約0.5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入15 mL體積分數為70%甲醇溶液，稱重，超聲處理30 min，待冷卻至室溫后，用70%甲醇溶液補足失重，搖勻取上清，用0.45 μm的微孔濾膜過濾即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度實驗

稱取S1樣品，按上述方法制備供試品溶液，并連續進樣6次，生成色譜圖。參照峰設置為連翹酯苷A（3號峰），并對本文標定的5個特征峰的相對峰面積及相對保留時間進行計算，結果顯示5個特征峰相對峰面積、相對保留時間的RSD分別小于2.42%、0.18%，均符合要求（RSD＜ 5%），表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性實驗

稱取S1樣品共6份，平行制備6份供試品溶液，注入高效液相色譜儀進行測定，生成色譜圖，參照峰設置為連翹酯苷A（3號峰），并對本文標定的5個特征峰的相對峰面積及相對保留時間進行計算，結果顯示5個特征峰相對峰面積、相對保留時間的RSD分別小于2.27%、0.13%，均符合要求（RSD＜5%），表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性實驗

稱取S1樣品，并按本文方法制備供試品溶液，分別于 0，4，8，12，24 h注入高效液相色譜儀中，生成色譜圖，參照峰設置為連翹酯苷A（3號峰），并對本文標定的5個特征峰的相對峰面積及相對保留時間進行計算，結果顯示5個特征峰相對峰面積、相對保留時間的RSD分別小于2.28%、0.15%，均符合要求（RSD＜ 5%），說明樣品溶液在24 h內基本穩定。

2.4 特征圖譜

2.4.1 特征圖譜的建立

取12批老翹樣品粉末，制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件測定。利用2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統”進行相似度分析，以S1樣品的色譜圖作為參照圖譜，并將S2～S12樣品的色譜峰與S1樣品的色譜圖進行自動匹配，生成對照圖譜（R），結果如圖1所示。選擇共有的主要色譜峰為特征峰，并與對照品比對，確定峰1為梾木苷甲基醚，峰2為蘆丁，峰3為連翹酯苷A，峰4為連翹苷，峰5為連翹脂素，如圖2所示。

圖1 老翹特征圖譜S1-S12：12批老翹藥材特征圖譜R：對照特征圖譜Fig.1 Characteristic chromatograms of ripe F.suspensaS1-S12：The characteristic chromatograms of 12 batches of ripe F.suspensa,R：control characteristic of the chromatogram

圖2 對照品色譜圖1：梾木苷甲基醚；2：蘆丁；3：連翹酯苷A；4：連翹苷；5：連翹脂素Fig.2 HPLC chromatogram of mixed reference substances1:suspensaside methyl ether,2:rutin,3:forsythoside A,4:phillyrin,5:phillygenin

2.4.2 特征峰相對保留時間的確定

將12批老翹樣品按“2.1”項下的色譜條件進行分析，參照峰設置為連翹酯苷A（3號峰），分別計算梾木苷甲基醚、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素的相對保留時間。結果顯示各特征峰相對保留時間均在規定值的±5%之內，規定值分別為：0.85（峰 1）、0.89（峰 2）、1.00（峰 3）、1.67（峰 4）、2.22（峰5）。以連翹酯苷A為參照峰，分別標定蘆丁、梾木苷甲基醚、連翹苷以及連翹脂素的相對保留時間，數據見表2。

表2 老翹各特征峰的相對保留時間Table 2 The relative retention time of each characteristic peak of ripe forsythia suspensa

2.4.3 老翹藥材特征圖譜相似度分析

將12批老翹樣品的色譜圖導入2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統”進行相似度分析，計算得到12批樣品與對照特征圖譜的相似度分別 為 0.926、0.906、0.961、0.978、0.981、0.947、0.949、0.959、0.971、0.921、0.921、0.973，表明各產地老翹飲片具有較高的相似性。

3 討論

3.1 提取條件確定

首先對提取溶劑進行考察，分別比較乙醇、甲醇、水等溶劑對樣品的提取效果，最終確定以甲醇作為提取溶劑，并對不同濃度甲醇提取效果進行了比較，發現70%甲醇（體積分數）作為提取溶劑時提取效率最高；其次，對提取方式進行了考察，分別比較了超聲提取法和加熱回流提取法的提取效率，確定以超聲提取法作為提取方法更為簡便，效率更高。

3.2 流動相選擇

分別對甲醇-0.4%醋酸水、乙腈-0.4%醋酸水、乙腈-水等流動相體系進行考察，并對該流動相的梯度洗脫時間進行考察，結果顯示流動相體系為乙腈-0.4%醋酸水時，各色譜峰分離效果較好且基線平穩；并以制備樣品色譜圖基線平穩、色譜峰信息量大，特征性強為依據確定本實驗的梯度體系。

3.3 檢測波長選擇

在老翹特征圖譜中，對235、280和330 nm三個波長進行檢測，結果顯示，在波長280 nm時，色譜圖基線平穩且供試品主要成分的分離度較好，色譜峰信息量大，紫外吸收峰強度較高，因此將280 nm作為特征圖譜的檢測波長。

3.4 特征峰選擇

老翹中主要含有苯乙醇苷類、木脂素和黃酮類成分，因此，本文分別選取了三類成分中具有代表性和特征性的連翹酯苷A、梾木苷甲基醚、連翹苷、連翹脂素和蘆丁作為老翹特征圖譜的特征峰。在連翹藥材中，連翹酯苷A的含量較高，活性較好，且該峰在本文的條件中分離度和穩定性均符合要求，所以將連翹酯苷A作為老翹特征圖譜的參照峰。此外，由于梾木苷甲基醚在老翹的甲醇提取物中含量較高，因此，本文建立的老翹特征圖譜與研究報道的青翹特征圖譜的最大區別在于增加了梾木苷甲基醚特征峰。

4 結論

本實驗通過HPLC法優化了老翹特征圖譜的條件，并通過對照品對照法確認了老翹甲醇提取物中梾木苷甲基醚、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素等5個特征成分，并對所建立的方法進行了精密度、穩定性和重復性等方法學考察，結果證明該方法有效可行。并對12批老翹樣品的特征圖譜進行特征峰相對保留時間與相似度分析，結果表明12批老翹的相似度可達到0.900以上，證明這12批老翹藥材具有較高的相似性，且5個特征峰重復性、專屬性好。本研究建立的老翹特征圖譜可以為評價老翹質量標準提供很好的依據。