N,P-CDs用于Al3+和pH的檢測及在細胞成像中的應(yīng)用

閆婭楠 ，劉洋 ，劉競 ，馮寧坤 ，宋勝梅 *，董川 *

（1.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 環(huán)境科學(xué)研究所，山西 太原 030006）

0 引言

目前，測定鋁含量的方法有很多種，包括電感耦合等離子體光譜法［8］、高效液相色譜法［9］和電化學(xué)法［10］等。盡管這些方法在檢測Al3+方面得到了廣泛的應(yīng)用，但是高昂的儀器設(shè)備和煩瑣的前處理過程限制其方法的進一步推廣［11-13］。因此渴望尋找一種更簡便的方法來檢測Al3+鋁離子。pH值的測量方法，包括核磁共振（NMR）［14］，微電極［15］，吸收光譜法和熒光法［16］。其中，熒光測定法因其響應(yīng)速度快、靈敏度高、無創(chuàng)性和實時監(jiān)測而具有非凡的競爭優(yōu)勢［17］。熒光成像與激光共聚焦掃描顯微鏡（LSCM）相結(jié)合可以為監(jiān)測活細胞的pH的變化提供高時空分辨率［18］。

碳點（carbon dots，CDs）［19］因其具有良好的光學(xué)性質(zhì)［20］、生物相容性［21］和較低的生物毒性［22］等，已廣泛應(yīng)用于各種離子的檢測、光學(xué)傳感、熒光pH探針等領(lǐng)域［23-25］，是構(gòu)建熒光傳感方法中重要的碳納米材料之一。例如，Li等［26］通過水熱法合成了CDs，間接檢測Al3+的存在。Fu等［27］通過電化學(xué)合成CDs用于檢測水溶液中的Al3+。因此，開發(fā)制備簡單、可直接檢測Al3+的CDs備受關(guān)注。在pH的檢測中，Guo等［28］通過一步水熱法制備的CDs用于檢測pH變化從1.00到3.00。Li等合成的CDs用于檢測pH在5.00～10.00的變化。

目前，大部分的碳點在檢測pH時主要集中在中性、極酸和極堿的體系中，而用于pH在4.00～6.00范圍內(nèi)檢測的CDs少有報道，檢測Al3+的方法多為間接檢測。本文針對目前Al3+和pH檢測中存在的問題，以對苯二胺為碳源，磷酸、乙二胺為磷和氮源，以微波法制備了N，P-CDs。該N，P-CDs可直接用于檢測Al3+，選擇性好，其線性范圍為73.0 μmol/L～ 120.0 μmol/L，檢測限為 21.03 μmol/L（S/N=3）。所制備N，P-CDs可在pH=4.00～6.00范圍內(nèi)靈敏地測定pH值，豐富了目前CDs用于檢測pH值的方法，同時該N，P-CDs可以用于LSCM進行HeLa細胞內(nèi)pH（4.00～6.00）的成像。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑：對苯二胺、磷酸（H3PO4）和乙二胺購自美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，硫酸鋁、氯化鈉、乙酸、硼酸、醋酸及香豆素307購自阿拉丁試劑有限公司。

主要儀器：Cary Eclipse熒光光譜儀（美國Varian公司）、Lambda 950型UV-Vis吸收光譜儀（英國蘭特里森特珀金埃爾默公司）、Tensor II型傅里葉紅外光譜儀（FTIR）（德國Bruker公司）、FLS920瞬態(tài)-穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀（英國Edinburgh公司）、FV1000型激光掃描共聚焦熒光顯微鏡（LSCM）（日本Olympus公司），Vario EL CUBE型元素分析儀（德國Elementar公司）、JEM-1011型透射電鏡（TEM）（日本電子光學(xué)公司，JEOL）、AXIS ULTRA DLD型X-射線光電子能譜（XPS）（日本Kratos公司）、SunRise酶標儀（奧地利Tecan Austria GmbH公司）。

1.2 N,P-CDs的制備

在50 mL燒杯中分別加入0.108 1 g對苯二胺、195 μL磷酸、960 μL乙二胺。反應(yīng)混合物在酸堿中和放熱的作用下迅速反應(yīng)。將其放入微波爐（1 000 W）中加熱3 min 20 s，冷卻后加入5 mL超純水，超聲使其溶解。將產(chǎn)物用濾紙和微濾膜（0.22 μmol·L-1）過濾除去大分子顆粒。之后置于燒杯中通過500 Da～ 1 000 Da的透析袋透析4 h，每2 h換一次二次水。最后將其冷凍干燥備用。

1.3 N,P-CDs熒光量子產(chǎn)率

以香豆素307（量子產(chǎn)率為0.56）為參比測定熒光量子產(chǎn)率。分別配制不同濃度的N，P-CDs溶液和香豆素307溶液，使用Lambda 950 UV-Vis吸收分光光度計測定各溶液在413 nm處的吸光度（保持吸光度值小于0.1，防止自吸效應(yīng)［29］。使用Varian Cary Eclipse熒光計記錄當激發(fā)波長為413 nm時的熒光光譜面積（選取418 nm～700 nm波長范圍內(nèi)熒光曲線下的面積積分）。然后繪制熒光積分面積與吸光度之間的曲線圖，以（1）式計算熒光量子產(chǎn)率：

Φ、η和K分別表示量子產(chǎn)率、溶液的折射率和五點法的斜率；x和st分別表示樣品和標準。

[37]人民網(wǎng)：《學(xué)漢語，原來含金量這么大》，http://www.hanban.edu.cn/article/2016-05/17/content_642047.htm，2016年5月17日。

1.4 N,P-CDs對Al3+的測定

為了確定N，P-CDs的選擇性，適量金屬離子鹽溶解于10 mL超純水得到16種0.1 mol/L的金屬離子溶液。配制10 mg/mL的N，P-CDs溶液，加水得到略大于5 mg/mL的N，P-CDs，再加入微量0.1 mol/L的 HCl，以pH計測量，得到pH=4.5（保持Al3+不水解）的5 mg/mL的N，P-CDs工作溶液。

在N，P-CDs的選擇性測定時，將金屬離子（20 μL，0.1 mol/L）加入到2 mL N，P-CDs的工作溶液中，測量其熒光強度。為了評估其他金屬離子對Al3+測定的干擾，通過將待測試離子（100 μL，0.1 mol/L）與2 mL的N，P-CDs工作溶液混合，進行熒光測量；隨后，再加入一定量的Al3+（20 μL，0.1 mol/L）溶液，再測量熒光強度。測定Al3+時，先測量2 mL N，P-CDs工作溶液的熒光強度，然后將合適體積的0.1 mol/L Al3+加入工作溶液中，測量其熒光強度。

以熒光光譜儀記錄激發(fā)波長為413 nm時，513 nm處發(fā)射波長的熒光強度，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，所有試驗重復(fù)3次（沒有特殊說明的熒光實驗均采用此熒光條件）。

1.5 細胞毒性及成像實驗

細胞毒性：將HeLa細胞接種到96孔板上，并在37℃、體積分數(shù)為5.0% CO2中培養(yǎng)24 h后，棄去上層液，給藥孔中加入含不同濃度N，P-CDs（0、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5和 25 mg/mL）的溶液。孵育一段時間后，將孔板內(nèi)的培養(yǎng)基換成MTT新鮮培養(yǎng)基（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)。最后，吸去上層液，加入二甲基亞砜，將所得混合物室溫震蕩10 min后，以酶標儀測量混合物的光密度（OD）［30］。

細胞成像：成像前，細胞先用10 mmol/L PBS（pH=7.40）沖洗3次；再在1 mL高K+緩沖溶液（120 mmol/L KCl、30 mmol/L NaCl、1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L Mg2SO4、1 mmol/L NaH2PO4、20 mmol/L NaOAC、5 mmol/L葡萄糖和20 mmol/L HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸））和5 μg/mL的尼日利亞霉素存在下，將細胞與碳點孵育10 min，在不同pH值（4.00、4.30、4.70、5.00、5.30、5.70、6.00）下，在LSCM上進行細胞內(nèi)pH熒光成像［28］。

1.6 實際樣品檢測

取實驗室自來水作為實際樣品進行檢測。首先將自來水進行過濾，然后將自來水和5 mg/mL的N，P-CDs工作溶液等體積混合，以0.1 mol/L的HCl通過pH計調(diào)節(jié)pH=4.5；取2 mL溶液加入1 cm比色皿中，再加入不同體積的Al3+標準溶液，測量熒光強度；根據(jù)工作曲線計算Al3+的含量，并計算加標回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 N,P-CDs的表征

元素分析數(shù)據(jù)結(jié)果表明N，P-CDs主要包括C、H、O、N和P五種元素，其質(zhì)量分數(shù)分別為28.35%、6.76%、31.51%（計算值）、20.05%和13.33%，經(jīng)計算N，P-CDs組成的經(jīng)驗式為C7H20O6N4P。以XPS對合成的N，P-CDs進行了表征。N，P-CDs的XPS總譜（圖1（a））共分為五個峰，分別為131.3、191.5、283.4、397.7和528.6 eV，對應(yīng)于P2p，P2s，C1s，N1s和O1s，確證了元素分析的結(jié)果。圖1（b）中高分辨O1s譜分裂為四個峰，結(jié)合能分別為 529.02、529.64、530.22和 530.88 eV，對應(yīng)于O-C-O、P=O、C-OH/C-O-C和P-O中的氧。圖1（c）中的高分辨C1s譜分裂為五個峰，結(jié)合能分別為 284.29、284.87、285.52、286.10和 287.32 eV，對應(yīng)于C=C、C-C/C-P、C-OH/C-O-C、C=N/C-P和C=O中的碳。高分辨的N1s（圖1（d））分別在397.85、398.35、399.0和399.83 eV處分解成四個峰，分別與C-N-C、N-（C）3、吡啶N和吡咯N相關(guān)［28］。圖1（e）顯示的是P2p譜的分峰，分別是位于133.37 eV的P2p3/2和133.83 eV的PC。N，P-CDs表面的官能團以FTIR表征如圖1（f）。2 855 cm-1為C-H伸縮振動峰，2 500 cm-1～2 760 cm-1為P-OH的彎曲振動，C=N拉伸以及-CH3的彎曲振動分別對應(yīng)1 569 cm-1和1 477 cm-1處。P-O-H、P-O-C和氫鍵型P=O分別在 960 cm-1、1 076 cm-1和 1 367 cm-1處［31］。這些實驗數(shù)據(jù)證明N和P被成功摻雜進所制備的CDs中。

圖1 （a）N，P-CDs的XPS總譜和高分辨（b）O1s譜；（c）C1s譜；（d）N1s譜和（e）P2p譜；（f）FTIR譜Fig.1 (a)XPS survey and high resolution spectrum of N,P-CDs(b)O1s,(c)C1s,(d)N1s,(e)P2p and(f)FTIR spectrum of N,P-CDs

所制備N，P-CDs的形貌和粒徑如圖2所示。圖2（a）表明納米顆粒呈球形或準球形，分散比較均勻，沒有明顯的團聚，圖2（b）表明粒徑分布范圍為1 nm～2 nm，粒徑分布較窄，平均粒徑為1.35 nm。高分辨圖譜沒有取到明顯的晶格條紋，說明所制備CDs為無定型，無明顯的晶格結(jié)構(gòu)。

圖2 （a）N，P-CDs的TEM和（b）粒徑分布圖Fig.2 (a)TEM image and(b)the diameter distribution of N,P-CDs

2.2 N,P-CDs的光學(xué)性質(zhì)

N，P-CDs的UV-Vis吸收光譜圖（圖3（a），藍線）有分別位于240 nm和300 nm的兩個吸收峰，分別對應(yīng)于苯環(huán)結(jié)構(gòu)的sp2雜化區(qū)域的π→π*躍遷和C=O鍵的n→π*躍遷，此外，在400 nm處有弱的寬吸收帶，可歸因于能量較低的官能團的電子躍遷。圖3（a）中左邊和右邊的插圖分別為自然光和365 nm激發(fā)下N，P-CDs溶液的顏色。圖3（a）中的紅線和黑線表明N，P-CDs的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為413 nm和513 nm，圖3（b）為N，P-CDs在340 nm～440 nm激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜，當激發(fā)波長從340 nm變化到440 nm（間隔10 nm）時，發(fā)射波長變化不顯著。以香豆素307為標準，通過（1）式計算得N，P-CDs的相對量子產(chǎn)率為2.6%。

圖3 （a）N，P-CDs的紫外可見吸收（藍線）和熒光（紅線激發(fā)，黑線發(fā)射）光譜；（b）不同激發(fā)波長下N，P-CDs的熒光發(fā)射光譜。圖a中插圖是自然光（左）和365 nm紫外燈（右）照射下N，P-CDs溶液的顏色Fig.3 （a）UV-Vis absorption（blue line）and fluorescence spectra（red line and black line are excitation and emission spectrum，respectively.）of N，P-CDs.（b）Fluorescence spectra of N，P-CDs at different excitation wavelengths

進一步考察了N，P-CDs的熒光穩(wěn)定性。圖4（a）表明當KCl溶液的體積濃度在0～ 4 mol/L范圍內(nèi)時，N，P-CDs在513 nm處的熒光強度變化較小，說明即使在較高的離子強度下，其熒光強度依然穩(wěn)定，因此所合成的N，P-CDs可用于生物體中。氙燈照射160 min后，N，P-CDs的熒光強度幾乎恒定（圖4（b）），說明N，P-CDs溶液的抗光漂白能力強。不同pH對N，P-CDs的熒光強度的影響如圖4（c），當溶液的pH值從1.00→8.00時，N，P-CDs的熒光強度隨pH的增大而增強；當pH值從8.00→13.00時，熒光強度隨pH的增大而減弱；在pH值4.00～6.00區(qū)間內(nèi)熒光強度發(fā)生突變。因此，進一步考察了pH在1.00～8.00區(qū)間內(nèi)對N，P-CDs熒光強度的影響。圖4（d）為不同pH下的熒光滴定曲線，以Boltzmann函數(shù)模擬得到圖4（e）所示的擬合曲線，得N，P-CDs的pKa=4.91，說明表面含有弱酸性官能團，這與FTIR譜上有以NH3+形式存在的氮一致。從N 1s XPS光譜中，氮原子也以吡啶N和吡咯N的形式存在。N，P-CDs的pH敏感性可歸因于其表面吡咯N、吡啶N和NH2的部分質(zhì)子化及去質(zhì)子化。另外，可逆性是pH熒光探針的一個重要標準。使用濃鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)N，P-CDs的pH在1.00～7.00之間波動來考察它的可逆性，如圖4（f）所示。結(jié)果表明，此過程完全是可逆的。說明，N，P-CDs對pH的響應(yīng)具有高度可逆性。

圖4 （a）不同濃度KCl溶液對N，P-CDs熒光強度的影響；（b）N，P-CDs的光穩(wěn)定性測試；（c）pH對N，P-CDs熒光強度的影響；（d）不同pH條件下N，P-CDs的熒光圖譜；（e）513 nm處的pH依賴性熒光強度的Sigmoidal/Boltzmann擬合。插圖顯示了N，P-CDs在pH（4.00～ 6.00）的線性關(guān)系；（f）N，P-CDs在pH=1.00～ 7.00之間熒光可逆變化Fig.4 (a)Effect of different concentrations of KCl on the fluorescence intensity of N,P-CDs.(b)Photostability of N,P-CDs excited at Xenon arc lamp for 160 min.(c)Effect of pH on the fluorescence intensity of N,P-CDs.(d)Fluorescence spectra of N,P-CDs in various pH value.(e)Sigmoidal/Boltzmann fitting of pH-dependent fluorescence intensity at 513nm.The inset displays the linear plot of N,P-CD against pH(4.00-6.00).(f)Fluorescence reversible response against pH varied repeatedly between 1.00 and 7.00

2.3 熒光方法檢測Al3+

圖5（a）表明大部分金屬離子對N，P-CDs的熒光強度沒有明顯影響，而Al3+對N，P-CDs的熒光猝滅程度較大，即所制備的N，P-CDs對Al3+有良好的選擇性。另外，考察了其他金屬離子存在時該N，PCDs抗干擾的能力（圖5（b）），當溶液中存在Al3+濃度10倍的其他金屬離子時，顯示對Al3+檢測并沒有明顯的干擾，說明N，P-CDs能夠選擇性識別Al3+而不受常見金屬離子的干擾。圖5（c）描述了在不同濃度的Al3+存在下N，P-CDs熒光強度的變化。同時在 73 μmol/L～ 120 μmol/L范圍內(nèi)Al3+的濃度與F/F0有良好的線性關(guān)系，檢出限為21.03 μmol/L（S/N=3）。如圖5（d）所示。不同參考文獻中的CDs的制備方法及對Al3+的檢測對比如表1。由表可見，我們制備CDs的方法用時較短，方法簡便，節(jié)省能源；且所制備CDs可以直接響應(yīng)Al3+，不需用間接的方法測定。參考文獻中間接方法測定Al3+時，在確定可準確檢測Al3+的最低濃度時是有困難的，需要多次試驗，反復(fù)測定以后才能準確確定，不如直接測定方法快捷。

圖5 （a）5 mg/mL N，P-CDs中加入20 μL，0.1 mol/L不同金屬離子后的熒光強度；（b）N，P-CDs檢測Al3+的抗干擾測試（黑條表示在N，P-CDs溶液中添加了金屬離子（100 μL，0.1 mol/L）。紅條表示隨后將Al3+（20 μL，0.1 mol/L）添加到N，P-CDs溶液中）；（c）5 mg/mL N，P-CDs在不同濃度Al3+存在時的熒光發(fā)射光譜；（d）F/F0與Al3+濃度的關(guān)系Fig.5 (a)Fluorescence intensity of 5 mg/mL N,P-CDs in the presence of different metal ions(20 μL,0.1 mol/L).(b)N,P-CDs detection Al3+ anti-interference test(The black bars represent the addition of other metal ions(100 μL,0.1 mol/L)to N,P-CDs solution.The red bars represent the subsequent addition of Al3+(20 μL,0.1 mol/L)to N,P-CDs solution).(c)Fluorescence emission spectra of N,P-CDs upon addition of various concentrations of Al3+.(d)The relationship between F/F0 and Al3+concentration

表1 不同方法制備的CDs用于檢測的比較Table 1 Comparison of CDs prepared by different methods for the detection of Al3+

為了闡明Al3+猝滅N，P-CDs的熒光的機理，分別測定了N，P-CDs和N，P-CDs中加入120 μmol/L Al3+后的熒光壽命（圖6（a）），計算出N，P-CDs和N，P-CDs/Al3+平均壽命分別為3.51 ns和3.81 ns，顯示Al3+加入后N，P-CDs的熒光壽命基本沒有發(fā)生明顯的變化，說明Al3+以靜態(tài)猝滅的方式猝滅了N，P-CDs的熒光。紫外滴定光譜如圖6（b）所示，隨著不同濃度的Al3+的加入，在498 nm左右出現(xiàn)了新的吸收峰，可能Al3+與N，P-CDs形成了復(fù)合物。比較N，P-CDs（圖2（f））與N，P-CDs中加入Al3+的FTIR圖6（c）可明顯看出，加入Al3+后N，P-CDs的峰位置和峰強度均發(fā)生了變化，表明熒光猝滅可能是由于Al3+與N，P-CDs表面的基團發(fā)生了配位，這與靜態(tài)猝滅的結(jié)果一致。

圖6 （a）5 mg/mL N，P-CDs和在120 μmol/LAl3+存在時N，P-CDs的熒光壽命；（b）不同濃度Al3+存在時N，P-CDs的UV-Vis吸收光譜圖；（c）加入Al3+后N，P-CDs的FTIR圖Fig.6 (a)Fluorescence lifetime of 5 mg/mL N,P-CDs and N,P-CDs in the presence of 120 μmol/LAl3+.(b)UV-Vis absorption spectra of the N,P-CDs and in the presence of different concentrations of Al3+.(c)FTIR spectra of N,P-CDs and N,P-CDs in the presence of Al3+

2.4 實際樣品中Al3+的測定

以所建立新的分析方法對實際水樣中Al3+含量進行了加標回收率實驗（表2）。誤差分析基于95% 置信度的t分布（t0.05，5=2.57）函數(shù)的雙邊檢驗。在實際樣品中沒有檢測到Al3+的存在。從表2得出，在自來水中檢測到的Al3+濃度與加入的濃度基本一致，回收率在95.0%～102.5%之間，相對標準偏差在1.40%～2.30%之間。此方法可以用于實際樣品中Al3+的檢測。

表2 自來水中Al3+的測定Table 2 Determination of Al3+ in tap water samples

2.5 N，P-CDs的細胞毒性及細胞成像

選用HeLa細胞作為模型細胞，以MTT法測定N，P-CDs的細胞毒性（圖7）。不同濃度N，P-CDs與細胞孵育24 h后，即使N，P-CDs的濃度達到12.5 mg/mL時，HeLa細胞的成活率仍然比較高，基本都在90%以上，表明N，P-CDs對細胞表現(xiàn)出較低的毒性，表明細胞成像的可行性。

圖7 不同濃度的N，P-CDs對HeLa細胞的毒性測定Fig.7 Cell viability(%)of HeLa cells after 24 h treatment with different concentration of N,P-CDs calculated from MTT assay

圖8為不同 pH（4.00、4.30、4.70、5.00、5.30、5.70、6.00和7.40）下5 mg/mL的N，P-CDs標記的HeLa細胞的熒光成像結(jié)果。由圖可見，N，PCDs可進入HeLa細胞質(zhì)，發(fā)出綠色熒光且細胞仍保持良好的形態(tài)，表明了N，P-CDs的良好生物相容性。隨著pH由4.00增加到7.00，熒光強度逐漸增強，并在pH=7.00時熒光達到最強。因此，N，P-CDs具有在活細胞內(nèi)檢測pH的潛在應(yīng)用價值。

圖8 HeLa細胞與N，P-CDs孵育后的LCSM圖。第一列為明場圖；第二列暗場圖；第三列為疊加場圖（pH=4.00，4.30，4.70，5.00，5.30，5.70，6.00和7.00）Fig.8 Fluorescence imaging of HeLa cells treated with N,PCDs.（a）bright field,（b）dark field,（c）overlay images of（a,b）（pH=4.00,4.30,4.70,5.00,5.30,5.70,6.00 and 7.00）

3 結(jié)論

本文以對苯二胺、磷酸、乙二胺為原料以微波法合成了N，P-CDs，基于熒光靜態(tài)猝滅的機理，構(gòu)建了一種綠色熒光納米探針識別Al3+的檢測方法。該探針在 Al3+濃度 73.0 μmol/L ～ 120.0 μmol/L的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。同時該碳點在pH 4.00～6.00范圍內(nèi)可靈敏地檢測pH值。MTT分析結(jié)果表明，N，P-CDs具有很好的生物相容性和低的生物毒性，可應(yīng)用于細胞成像，為環(huán)境和生物傳感應(yīng)用提供了一種新方法。