蘇木抗乳腺癌活性成分的篩選及其作用效果研究

梁永琴，楊喜花，，趙莉莉，陳麗霞 ，賀俊飛，張生萬*

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省腫瘤研究所 實(shí)驗(yàn)動物中心，山西 太原 030013）

0 引言

蘇木是豆科云實(shí)屬植物蘇木（Caesalpinia sappan L.）的心材，是我國傳統(tǒng)的中藥。在國內(nèi)主要分布于云南、海南、廣西等地，在國外主要分布于地中海、非洲北部以及土耳其等［1］。《中國藥典》記載其味苦、咸、微辛、性平，具有活血散淤、舒筋通絡(luò)等功效，主要用于骨折傷筋、跌打損傷［2］等的醫(yī)治。此外，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)蘇木提取物具有抗腫瘤［3］、抗氧化［4］、抗菌［5］、抗炎［6］、降血糖［7］以及免疫抑制［8］等作用。

乳腺上皮組織出現(xiàn)癌變細(xì)胞后，基因失去對其的調(diào)控而無限增殖，形成一種常見的惡性疾病——乳腺癌。近年來，全球乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)逐年上升趨勢［9］，對人類健康和生命造成極大的威脅。因此，乳腺癌的治療一直是人們在努力解決的問題。目前，乳腺癌的治療模式為手術(shù)，輔助化療或放療［10］，化療藥物等有助于控制腫瘤的發(fā)展，但同時(shí)可破壞正常細(xì)胞，患者極易出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)［9］，而天然產(chǎn)物及其衍生物是各種藥物先導(dǎo)化合物的重要源泉，故從活性天然產(chǎn)物骨架中尋找新藥，是今后藥物研發(fā)的重要途徑［11］。

近年來，中藥蘇木已被證實(shí)對多種腫瘤細(xì)胞均有顯著抑制作用［12-19］，其抗腫瘤機(jī)制的研究也愈加深入，大多是集中于蘇木提取物抗腫瘤相關(guān)工作的研究，但中藥成分極為復(fù)雜，對其抗腫瘤活性成分的篩選與鑒定研究相對較少。目前被分離鑒定的活性成分有巴西蘇木素和原蘇木素B，且針對膀胱癌的研究較多，如楊喜花等［20］研究表明蘇木中活性成分原蘇木素B可以抑制T24細(xì)胞，BTT細(xì)胞和5637細(xì)胞的增殖；張婷婷等［21］證實(shí)蘇木中活性成分巴西蘇木素可通過c-Fos和GADD45β介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞特異性信號通路抑制T24細(xì)胞生長并引發(fā)細(xì)胞凋亡。關(guān)于蘇木提取物對乳腺癌是否起作用以及具體活性成分的研究鮮有報(bào)道，因此我們開展了蘇木抗乳腺癌活性成分的篩選及其作用效果的研究，以期為蘇木提取物以及其活性成分在臨床上的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

蘇木，安徽盛海堂中藥飲片有限公司；甲醇，色譜純，歐普森色譜純試劑廠家；乙酸乙酯、石油醚、甲酸，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；DMEM medium high glucose，BBI Life Sciences；Gibco RPMI1640培養(yǎng)基，Life Technologies公司；MTT，Solarbio公司；DMSO，Sigma公司；MDA-MB-231細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、4T1細(xì)胞，山西大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院饋贈；巴西蘇木素（質(zhì)量百分含量達(dá)98%），由山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張生萬教授提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Waters 1525高效液相色譜儀，美國Waters公司；2996 PDA檢測器；Empower色譜工作站；Agela Venusil XBP-C18，Agela公司；FT-IR紅外光譜儀，美國熱電公司；ACB-4A1超凈工作臺，新加坡藝思高科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific；SunRise酶標(biāo)儀，奧地利Tecan公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘇木提取物樣品的制備

蘇木提取物的制備采用文獻(xiàn)［12］的方法進(jìn)行，即蘇木藥材經(jīng)過煎煮提取，脫脂處理，萃取除雜，干粉精制后制得提取物。分別稱取16份蘇木干燥心材各500 g，經(jīng)改變粒徑（未粉碎或粉碎）、溶劑（水或體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%的乙醇）、料液比（1∶5、1∶6或1∶7）、提取時(shí)間（24 h或48 h）、提取次數(shù)（4次或5次）、脫脂次數(shù)（0次或1次）、萃取除雜次數(shù)（0次或1次）以及精制次數(shù)（0次、2次或3次），制得1-16號樣品。

1.3.2 蘇木提取物樣品各組分相對含量的測定

準(zhǔn)確稱取1-16號被測樣品各5 mg于5 mL容量瓶中，用18%的甲醇溶液定容，0.45 μm微孔濾膜過濾備用，采用液相色譜法測定并計(jì)算各組分相對含量。

高效液相色譜條件參照陳雪敏等建立的方法［22］，并按表1所示程序進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.3 蘇木提取物對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率

采用MTT法［23］檢測蘇木提取物的1-16號樣品對人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的抑制作用。復(fù)蘇MDA-MB-231細(xì)胞，用常規(guī)培養(yǎng)方法傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期、生長狀況良好的細(xì)胞，于超凈工作臺內(nèi)接種于兩塊無菌96孔板（1×105、0.5×105個(gè)/孔），每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)過夜。次日觀察細(xì)胞貼壁完好，輕輕棄掉原培養(yǎng)基，處理組依次加入200 μL含蘇木提取物的1-16號樣品培養(yǎng)基（終濃度為 100 μg/mL），對照組不加藥。并設(shè)立調(diào)零組，每組5個(gè)復(fù)孔。96孔板放入培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h后，將所有孔內(nèi)原培養(yǎng)基輕輕吸出，每孔加入含MTT的培養(yǎng)基（終濃度為0.5 mg/mL）100 μL，放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4 h，小心去除孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔避光加入150 μL DMSO，于酶標(biāo)儀中振蕩 10 min，使結(jié)晶充分溶解，并測定在490 nm波長下的吸光度（A）值，計(jì)算蘇木提取物1-16號樣品對MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率。抑制率的計(jì)算如公式（1）：

1.3.4 蘇木提取物抑制乳腺癌活性成分的篩選

以蘇木提取1-16號樣品的序號為橫坐標(biāo)，分別以蘇木提取物各組分含量及其抑制率為縱坐標(biāo)作圖，考察蘇木提取物的1-16號樣品中各組分濃度和抑制率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）者即為活性成分。

1.3.5 巴西蘇木素對乳腺癌細(xì)胞MCF-7、4T1和MDA-MB-231的抑制作用

將乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、4T1和MDA-MB-231用常規(guī)培養(yǎng)方法傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期、生長狀況良好的上述乳腺癌細(xì)胞接種于96孔板（0.8×105、1×105、0.8×105個(gè)/孔），采用 MTT法［20］分別檢測不同濃度巴西蘇木素（終濃度分別為12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL）對3種細(xì)胞的抑制率，計(jì)算3種乳腺癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。并檢測巴西蘇木素在對 MCF-7、4T1和 MDA-MB-231作用的 IC50下對各細(xì)胞作用不同時(shí)間（3 h、6 h、12 h、24 h和48 h）的抑制率。IC50的計(jì)算見公式（2）：

其中，Xm：Ig最大劑量；I：Ig（最大劑量/相鄰劑量）；P：陽性反應(yīng)率之和；Pm：最大陽性反應(yīng)率；Pn：最小陽性反應(yīng)率。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 21軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以xˉ±s表示，采用Pearson相關(guān)性分析；若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用單因素方差分析，方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，若呈非正態(tài)分布則用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘇木提取物樣品中各組分含量的測定結(jié)果

蘇木提取物典型的高效液相色譜圖如圖1所示，1-16號樣品中對應(yīng)各組分相對含量如表2所示。

由圖1可知，在給定色譜條件下蘇木提取物很好地分離，其主要組分保留時(shí)間分別為9 min、14 min、24 min、36 min和46 min的物質(zhì)。由表2可以看出，不同提取方法所得的16種樣品中，各組分濃度差異明顯，能夠進(jìn)行活性成分篩選的相關(guān)性分析。

表2 高效液相色譜面積歸一化法測定蘇木提取物的1-16號樣品中主要組分相對含量結(jié)果Table2 Determination of relative content of main components in No.1-16 Sappan L.extract by area normalization method of HPLC

圖1 蘇木提取物液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of extract of Sappan L.

2.2 蘇木提取物對MDA-MB-231細(xì)胞抑制作用效果

蘇木提取物的1-16號樣品對MDA-MB-231細(xì)胞作用24 h和48 h的抑制效果見表3。

表3 蘇木提取物的1—16號樣品對MDA-MB-231細(xì)胞抑制率Table 3 Results of inhibition of MDA-MB-231 cells by No.1-16 Sappan L.extract

由表3可知：蘇木提取物的1-16號樣品對MDA-MB-231細(xì)胞作用24 h的抑制率均在50%以上，作用48 h時(shí)抑制率均明顯提高，且多個(gè)樣品抑制率高達(dá)95%以上，表明蘇木提取物樣品對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間依賴性，并且各樣品的抑制率有較大差異。

2.3 蘇木提取物抑制乳腺癌的活性成分篩選結(jié)果

蘇木提取物1-16號樣品的抑制率結(jié)果如圖2所示，相關(guān)系數(shù)如表4所示。

表4 蘇木提取物各組分與MDA-MB-231細(xì)胞抑制率在不同時(shí)間下相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients between components of Sappan L.extract and inhibition rate of MDA-MB-231 cell at different times

圖2 各組分含量對MDA-MB-231細(xì)胞抑制率相關(guān)性曲線（圖b為圖a的局部放大圖）Fig.2 Correlation curve between the content of each compo‐nent and the inhibition rate of MDA-MB-231 cells（Fig.b is a locally enlarged image of Fig.a）

由圖2和表4可知，蘇木提取物保留時(shí)間為14 min的組分的含量變化與其對MDA-MB-231細(xì)胞作用24 h和48 h的抑制率變化趨勢相一致，其余4種組分的含量與抑制率的關(guān)系不明顯（圖2（b））；且保留時(shí)間為14 min的組分含量與MDA-MB-231細(xì)胞抑制率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.845和0.740故確定保留時(shí)間為14 min的組分是蘇木提取物抗乳腺癌的主要活性成分。

2.4 蘇木提取物抑制乳腺癌活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定

按1.3.1蘇木提取樣品的制備方法所得粗提物，經(jīng)多次精制處理后的液相色譜圖如圖3所示，其保留時(shí)間為14 min組分的相對含量為98%，并經(jīng)紅外光譜測定其結(jié)果如圖4所示，3 386.51 cm-1寬而強(qiáng) 的 νO-H峰 和 1 302.00 cm-1、1 230.64 cm-1強(qiáng) 的ν?-o峰，表明該物有酚羥基的存在；1 158.45 cm-1強(qiáng)的νC-O峰，表明有叔醇羥基存在；3 036 cm-1的ν=?-H和 1 622.32、1 598.49、1 507.71 cm-1的 νC=C以及 962.67、867.58、776.14 cm-1的 γ?-H吸收 ，充分表明分子中有 1，2，4三取代和 1，2，4，5四取代苯基存在。且此樣品紅外圖譜與文獻(xiàn)［12］中巴西蘇木素標(biāo)準(zhǔn)譜圖一致，故確定其為巴西蘇木素。

圖3 精制樣品的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of refined samples

圖4 精制樣品的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of refined samples

2.5 巴西蘇木素對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7和4T1的抑制作用結(jié)果

實(shí)驗(yàn)考察了巴西蘇木素在濃度梯度12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL下對MDA-MB-231、MCF-7和4T1三種乳腺癌細(xì)胞的抑制率見圖5。

由圖5可見，巴西蘇木素在各濃度下對MDAMB-231、MCF-7和4T1三種乳腺癌細(xì)胞均有極顯著的抑制效果（P＜0.01），且作用效果隨作用濃度的增大而增加。巴西蘇木素對MDA-MB-231、MCF-7和 4T1 作用的 IC50依次為 20.52 μg/mL、50.12 μg/mL 和 9.2 μg/mL。

圖5 不同濃度巴西蘇木素對三種乳腺癌細(xì)胞抑制率的影響Fig.5 Effect of different concentrations of brazilin on the in‐hibition rate of three breast cancer cells

巴西蘇木素在半數(shù)致死濃度下對MDA-MB-231、MCF-7和4T1三種乳腺癌細(xì)胞分別處理3 h、6 h、12 h、24 h和48 h后的抑制率結(jié)果見圖6。

由圖6可知，巴西蘇木素在3 h、6 h、12 h、24 h和48 h下對三種乳腺癌細(xì)胞均有顯著抑制作用，與對照組比較差異顯著（P＜0.01），且巴西蘇木素對3種乳腺癌細(xì)胞的抑制效果隨著作用時(shí)間的延長而增加。

圖6 巴西蘇木素處理不同時(shí)間對三種乳腺癌細(xì)胞抑制率的影響Fig.6 Effects of different treatment times of Brazilian on the inhibition rate of three breast cancer cells

3 討論

惡性腫瘤是重大的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危害人類的健康。乳腺癌常見的療法為手術(shù)聯(lián)合放化療法，但是化療藥物殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會對機(jī)體正常細(xì)胞產(chǎn)生損傷，且藥物易產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響治療效果［24］。因此，尋求低毒、有效的治療藥物具有重要意義。中藥藥效廣泛、毒副作用小，在治療腫瘤的過程中，不僅可以通過調(diào)節(jié)多種分子機(jī)制緩解腫瘤引起的不良反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤作用，還可以提高機(jī)體免疫力，延長生存期［25］。由于中藥化學(xué)成分極為復(fù)雜、藥理機(jī)制眾多，對中藥多靶點(diǎn)之間相互聯(lián)系了解不夠深入，研究進(jìn)程較為緩慢，故對其活性成分進(jìn)行篩選與鑒定具有極為重要的意義。

本研究以中藥蘇木為研究對象，對其抗乳腺癌活性成分進(jìn)行篩選，鑒定，驗(yàn)證。首先，將蘇木提取物各組分含量與乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞抑制率的相關(guān)性研究表明，細(xì)胞抑制率與巴西蘇木素含量呈正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)在0.740以上，故確定巴西蘇木素是蘇木中抗乳腺癌的主要活性成分。其次，用巴西蘇木素對照品對以上結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示，巴西蘇木素對不同乳腺癌細(xì)胞均具有很好的增殖抑制活性，且呈劑量和時(shí)間依賴性。以上結(jié)果說明，蘇木提取物中對不同乳腺癌細(xì)胞起抑制作用的活性成分為巴西蘇木素，為乳腺癌的臨床治療、蘇木活性成分巴西蘇木素開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。本課題組賀俊飛等對中藥蘇木抑制胃癌活性組分進(jìn)行篩選，本研究在此基礎(chǔ)上，對蘇木抗乳腺癌的活性成分進(jìn)行初步的篩選，并進(jìn)一步經(jīng)紅外光譜對活性成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，以3種不同的乳腺癌細(xì)胞為研究對象，對其作用效果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明巴西蘇木素對不同的乳腺癌細(xì)胞均有顯著的抑制效果。