何首烏多糖對(duì)氧自由基及抗氧化酶活性的作用研究

梁闖

何首烏又名紫烏藤、花蓼、夜交藤等,為蓼科植物何首烏的干燥塊根［1］。性微溫、味苦、澀、甘,具有活血、安神、解毒、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)益精血、滋補(bǔ)肝腎之效,為常見(jiàn)貴細(xì)中藥材［2］。近年來(lái),關(guān)于何首烏中蒽醌類(lèi)、磷脂類(lèi)化合物和二苯乙烯類(lèi)成分的研究報(bào)道較多,但對(duì)于何首烏多糖的研究較少［3］。多糖是生物體內(nèi)除核酸和蛋白質(zhì)的另一重要分子,具有多種生物活性,多糖廣泛存在于植物、微生物和海藻中,植物中多糖分布尤為廣泛,生理活性廣泛［4］。有研究表明,何首烏多糖具有抗氧化、抗衰老活性［5］?；诖?本文采用小鼠注射D-半乳糖造模,提取何首烏多糖進(jìn)行灌胃,研究何首烏多糖對(duì)氧自由基及抗氧化酶活性的作用,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇昆明種小鼠40 只,雌雄各20 只,小鼠體重15～25 g,平均體重(20.14±2.14)g。將40 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、小劑量、大劑量何首烏多糖組,每組10 只。

1.2 細(xì)胞和試劑 MDA 測(cè)試盒(北京靈寶科技有限公司),SOD 測(cè)試盒(上海信裕生物科技有限公司),GSHPX 測(cè)試盒(上海艾研生物科技有限公司),其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 制備何首烏多糖 取新鮮何首烏粉碎過(guò)篩,用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇脫脂,所得殘?jiān)谜麴s水提取,采用苯酚-硫酸法測(cè)定提取液中何首烏多糖含量,測(cè)得多糖含量為87.6%。

1.4 給藥方法 四組小鼠均采用灌胃法給藥,對(duì)照組和模型組予以對(duì)照液(只含防腐劑-尼泊金乙酯)灌胃,小劑量、大劑量何首烏多糖組分別予以50 mg/(kg·d)和150 mg/(kg·d)何首烏多糖灌胃,同時(shí),模型組和小劑量、大劑量何首烏多糖組每日頸背部皮下注射5%D-半乳糖0.5 ml,對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水,灌胃8 周后,斷頭取血,取小鼠腦、肝、腎等部位進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

1.5 小鼠血清、肝、腎組織中SOD 活力測(cè)定 采用亞硝酸鹽法測(cè)定,取小鼠10 μl 血清或50 μl 1%的肝、腎組織勻漿,按照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作,加入試劑,將試管震蕩搖勻,37℃水浴40 min,后加入顯色劑,10 min后于550 nm 處測(cè)吸光度值,用測(cè)得結(jié)果計(jì)算小鼠血清、肝、腎組織中SOD 活力。

1.6 小鼠血清、肝、腎組織中MDA 測(cè)定 采用TBA比色法測(cè)定,將小鼠血清、肝、腎組織用Tris-HCL 緩沖液配成10%組織勻漿,取0.1 ml 勻漿,按照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作,加入試劑,將試管震蕩均勻,水浴、煮沸40 min,后以3500 r/min 離心,共10 min,于532 nm 處測(cè)吸光度值,用測(cè)得結(jié)果計(jì)算小鼠血清、肝、腎組織中MDA 含量。

1.7 小鼠肝、腎組織中GSH-PX 活力測(cè)定 采用DTNB 法進(jìn)行測(cè)定,取小鼠0.2 ml 1%的肝、腎組織勻漿和0.2 ml、1 mmol/L 的GSH,37℃水浴溫5 min,按照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作,加入試劑,于37℃術(shù)中反應(yīng)5 min,后以3500 r/min 離心,共10 min,取上清液向其中加入顯色劑,室溫下靜置15 min,于412 nm 處測(cè)吸光度值,用測(cè)得結(jié)果計(jì)算小鼠肝、腎組織中GSH-PX 活力。

1.8 小鼠腦組織中LF 測(cè)定 采用Sohal 法,取100 mg小鼠大腦,向其中加入4 ml 2∶1 氯仿-甲醇提取液,搖勻,過(guò)濾,用提取液洗滌濾渣,合并濾液,加提取液總量至5 ml,測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.9 觀察指標(biāo) 比較四組小鼠血清、肝、腎組織中SOD 活力、MDA 含量,肝、腎組織中的GSH-PX 活力,腦組織中LF 熒光值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠各組織中SOD、GSH-PX、MDA 對(duì)比模型組小鼠血清、肝、腎組織中SOD 活力及肝、腎組織中的GSH-PX 活力均較對(duì)照組顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；小劑量何首烏多糖組、大劑量何首烏多糖組小鼠血清、肝、腎組織中SOD 活力及肝、腎組織中的GSH-PX 活力均較模型組升高,且大劑量何首烏多糖組高于小劑量何首烏多糖組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。模型組小鼠血清、肝、腎組織中MDA 含量均較對(duì)照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；小劑量何首烏多糖組、大劑量何首烏多糖組小鼠血清、肝、腎組織中MDA 含量均較模型組降低,且大劑量何首烏多糖組低于小劑量何首烏多糖組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 四組小鼠各組織中SOD、GSH-PX、MDA 對(duì)比()

表1 四組小鼠各組織中SOD、GSH-PX、MDA 對(duì)比()

注：與對(duì)照組對(duì)比,aP＜0.05；與模型組對(duì)比,bP＜0.05；與小劑量何首烏多糖組對(duì)比,cP＜0.05

2.2 四組小鼠腦組織中LF 熒光值對(duì)比 對(duì)照組小鼠腦組織中LF 熒光值為(18.04±1.65),模型組為(20.36±1.87),小劑量何首烏多糖組為(16.32±1.35),大劑量何首烏多糖組為(14.68±2.10)。模型組小鼠腦組織中LF 熒光值較對(duì)照組升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；小劑量何首烏多糖組、大劑量何首烏多糖組小鼠腦組織中LF 熒光值較模型組降低,且大劑量何首烏多糖組低于小劑量何首烏多糖組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

在生物生長(zhǎng)過(guò)程中,生物不斷產(chǎn)生氧自由基,包括羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2-)以及有機(jī)自由基(R-、RO-、ROO-),具有極強(qiáng)的生物活性［5］。少量氧自由基在細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、解毒、消炎等方面有較大作用,但自由基過(guò)?？烧T發(fā)生物膜系統(tǒng)與細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸酶障礙,從而導(dǎo)致人體發(fā)生免疫失調(diào)、炎癥、惡性腫瘤等疾病,并誘發(fā)機(jī)體衰老和死亡［6］。

脂質(zhì)過(guò)氧化是氧自由基損傷的主要方式,主要損傷途徑為細(xì)胞膜脂質(zhì)+氧自由基-脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)-過(guò)氧化脂質(zhì)-細(xì)胞成分+MDA-脂褐質(zhì)［7］。機(jī)體本身具有抗氧化系統(tǒng),存在如SOD、GSH-PX 等抗氧化酶,SOD 對(duì)機(jī)體氧化和抗氧化平衡有著重要意義,可有效清除O2-,保護(hù)細(xì)胞,避免受到氧自由基攻擊。GSH-PX對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)和·OH 有較強(qiáng)的清除能力,可有效保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整。MDA 與LF 含量反映了機(jī)體受氧自由基攻擊的程度［8］。在疾病狀態(tài)下,由于多方面因素影響,使機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除過(guò)程失衡,就會(huì)導(dǎo)致組織、細(xì)胞、酶、基因等受損。抗氧化劑可通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)或清除過(guò)剩自由基而起抗氧化作用,因此,研究抗氧化劑對(duì)預(yù)防疾病有重要意義。D-半乳糖在機(jī)體內(nèi)代謝時(shí),可產(chǎn)生大量自由基,降低機(jī)體抗氧化能力,脂質(zhì)水平增加,引起機(jī)體亞急性衰老,主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的堆積和抗氧化物酶活性的降低［9］。

何首烏是常見(jiàn)的一種貴細(xì)中藥材,其主要入藥部位為根塊,其有著截瘧、消癰、解毒、活絡(luò)、養(yǎng)血以及安神的功效,且何首烏經(jīng)過(guò)加工處理后,被用在補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、烏須發(fā)以及補(bǔ)益精血的過(guò)程中。何首烏多糖是何首烏中提取出的一種活性成分,近年來(lái)對(duì)何首烏多糖的研究表明,何首烏多糖具有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)及抗老年癡呆癥作用［10］。相關(guān)研究針對(duì)何首烏多糖進(jìn)行了較為全面的深入分析,王婭等［11］從何首烏中提取分離多糖,分析其免疫調(diào)節(jié)功能的相關(guān)情況,采用二維核磁共振波譜對(duì)何首烏多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行切入分析,結(jié)合其對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 的相關(guān)影響情況,得到最終結(jié)論為何首烏多糖作為絕對(duì)分子質(zhì)量為3.96×105的α-1,4-葡聚糖,其進(jìn)入體內(nèi)后可以有效促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞的吞噬能力增加,刺激增殖情況的改善,進(jìn)一步引導(dǎo)小鼠釋放出更多的一氧化氮(NO),證明了其存在一定的藥用價(jià)值,可以有效調(diào)節(jié)免疫活性。程凱等［12］文獻(xiàn)中證實(shí)何首烏多糖的使用可以有效改善小鼠體內(nèi)的氧化情況,有著較為理想的抗疲勞效應(yīng)。此次研究同上述相關(guān)文獻(xiàn)均可以從正面或者側(cè)面證明何首烏多糖有可抑制過(guò)氧化的功能,均具有一定的研究?jī)r(jià)值。

本研究中,給予D-半乳糖造模小鼠灌胃50、150 mg/(kg·d)的何首烏多糖,小鼠血清、肝、腎組織中MDA 和腦組織中LF 不同程度下降,血清、肝、腎中SOD 和肝、腎中GSH-PX 活力提高,由此可見(jiàn),何首烏多糖可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化,并明顯清除O2-、H2O2等活性氧［11,12］。

綜上所述,何首烏多糖在抗脂質(zhì)氧化、提高內(nèi)源性抗氧化酶活性、對(duì)抗與自由基所致相關(guān)疾病方面有重要意義,相關(guān)研究人員可以將其作為研究方向進(jìn)行下一步深入研究,為疾病治療的臨床提供相關(guān)指導(dǎo)意義與價(jià)值。