肝癌血清外泌體環(huán)狀RNA表達(dá)譜差異及其臨床意義

李葉晟，楊宗國(guó)，陳晹，劉嬌，張猛，陳天佑，陸云飛，陳曉蓉，黃楊卿

（上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508，1.肝膽外科，2.中醫(yī)科，3.介入科）

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，是全球第二大癌癥相關(guān)死亡原因。如早期確診并及時(shí)干預(yù)治療，患者預(yù)期壽命可顯著提高；但在晚期診斷為轉(zhuǎn)移時(shí)，即便使用多激酶抑制劑索拉非尼或瑞戈非尼治療，患者的預(yù)后也較差[1]。因此，探索肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的相關(guān)標(biāo)志物具有十分重要的臨床意義。環(huán)狀RNA（circRNA）是指一類(lèi)在真核細(xì)胞中廣泛存在的具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA。原本大多數(shù)circRNA被認(rèn)為是無(wú)意義的選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本，然而近幾年來(lái)，大規(guī)模深度測(cè)序方面的研究揭示了circRNA具有廣泛生物功能，特別是circRNA在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用，已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一[2-3]。外泌體是含有不同功能分子的雙層納米級(jí)（直徑30～150 nm）胞外小泡，其內(nèi)容物非常豐富，包涵各種生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和核酸、以及長(zhǎng)鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA（circRNA），外泌體途徑釋放的circRNA被認(rèn)為是circRNA發(fā)揮信息傳遞功能的有效途徑[4]。關(guān)于circRNA在肝癌進(jìn)展中的生物作用已有初步的研究報(bào)道[5]，但是對(duì)于外泌體途徑轉(zhuǎn)運(yùn)的circRNA與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚未明確。

本研究對(duì)肝細(xì)胞癌患者血清外泌體circRNA進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序分析，對(duì)篩選得到的差異化表達(dá)circRNA進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步分析其中差異顯著的血清circRNA與肝癌患者臨床特征的相關(guān)性，為探索外泌體circRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

用于circRNA芯片檢測(cè)的3例肝細(xì)胞癌血清樣本來(lái)自上海市公共衛(wèi)生臨床中心2018年收治的肝癌患者，3例健康志愿者血清樣本來(lái)自本院同期體檢的人群。3例肝癌患者HBsAg均陽(yáng)性，未行放化療或靶向治療，年齡分別為47、51和56歲，其中男2例，女1例；血甲胎蛋白（AFP）＞400 ng/mL；腫瘤最大徑＞5 cm；BCLC分期為2例C期和1例B期。

用于驗(yàn)證分析的肝癌血清樣本來(lái)自本院2014年1月至2015年12月期間收治的進(jìn)行手術(shù)切除的患者，失訪患者6 例，最終納入統(tǒng)計(jì)患者62 例，病理特征見(jiàn)表1。用于對(duì)照分析的62 例健康志愿者血清樣本來(lái)自本院同期體檢的人群。所有肝癌患者經(jīng)病理確診為原發(fā)性肝癌，HBsAg均陽(yáng)性，術(shù)前均未行放化療或靶向治療。本研究隨訪通過(guò)電話和門(mén)診復(fù)診的方式開(kāi)展，隨訪截止時(shí)間為2020年12月，患者死于肝癌為終點(diǎn)事件，死于其他疾病、失訪或至隨訪結(jié)束時(shí)患者存活為截尾事件。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（公衛(wèi)倫審2020-Y080-01號(hào)），患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 血清外泌體提取和鑒定

采用總外泌體分離試劑盒（Invitrogen公司，貨號(hào)：4484450）提取試劑，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行血漿外泌體提取操作。根據(jù)文獻(xiàn)[6]，利用透射電鏡觀察醋酸鈾酰-檸檬酸鉛雙染色后的外泌體形態(tài)。利用納米顆粒跟蹤技術(shù)（Nanosight NS 300系統(tǒng)）分析測(cè)定外泌體粒徑大小及分布。利用Western blotting 檢測(cè)外泌體表面蛋白標(biāo)志物CD9（Abcam公司，貨號(hào)：ab236630）和CD63（Abcam公司，貨號(hào)：ab134045）的表達(dá)。

1.3 circRNA芯片檢測(cè)

使用TRIzol試劑分離提取血清外泌體總RNA，并使用RNeasy mini Kit進(jìn)行純化，然后使用Super RNA Labeling方法對(duì)RNA進(jìn)行cDNA擴(kuò)增和熒光標(biāo)記，將標(biāo)記后的樣本與Human circRNA Array V2（8 X 15K）芯片（Arraystar公司）進(jìn)行排列雜交。使用Feature Extraction software 10.7提取數(shù)據(jù)，通過(guò)R語(yǔ)言的Limma語(yǔ)言包對(duì)芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，篩選出相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)＞2 且P＜0.05 的circRNA。委托上海康成生物公司提完成circRNA芯片檢測(cè)、圖像采集、數(shù)據(jù)分析等。

1.4 RT-PCR定量檢測(cè)

使用TRIzol試劑提取血清樣本總RNA，按照Prime Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說(shuō)明書(shū)在進(jìn)行PCR檢測(cè)。circRNA引物設(shè)計(jì)委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。所有PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，采用2-ΔΔCT法計(jì)算歸一化到GAPDH基因的相對(duì)表達(dá)量，其中所用引物序列分別為：circNFIC發(fā)散引物正向序列：5’-CTCGTAGACG GTTCTGCGG-3’，反向序列：5’-TCGCCAATCAGC CATTTG-3’；GAPDH引物正向序列：5’-GGTGAAG GTCGGAGTCAACG-3’，反向序列：5’-CAAAGTTG TCATGGATGHACC-3’。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 7.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料使用（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，若整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)，并繪制生存曲線。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清外泌體的分離和鑒定

透射電鏡（圖1A）觀察到肝癌患者和健康志愿者血清外泌體為圓形、雙層膜囊狀的顆粒，粒徑約 100 nm；粒徑分析（圖1B）顯示，外泌體粒徑曲線呈單峰正態(tài)分布狀，粒徑集中在100 nm左右，符合外泌體表象特征。Western blotting結(jié)果（圖1C）顯示，外泌體標(biāo)志蛋白CD9/CD63 表達(dá)顯著，證實(shí)外泌體的分離純化成功，能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 血清外泌體的分離和鑒定

2.2 血清外泌體circRNA表達(dá)譜差異化分析

利用circRNA芯片進(jìn)行高通量篩選，對(duì)比肝癌患者和健康志愿者血清外泌體中circRNA表達(dá)譜差異，芯片檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示，火山圖中標(biāo)注了相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)＞2且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的circRNA，肝癌患者血清外泌體中存在顯著差異化表達(dá)的circRNA共2 094 條，其中表達(dá)上調(diào)1 168的條，表達(dá)下調(diào)的926條。

本研究選擇表達(dá)升高且差異程度最顯著的前10 種circRNA在62 例肝癌患者和62 例健康志愿者的血清外泌體樣本進(jìn)行驗(yàn)證，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖2B所示，與健康志愿者組相比，肝癌患者血清外泌體中有5種circRNA表達(dá)顯著增加，其中hsa_circ_ 0002018 相對(duì)表達(dá)量為（10.98±2.85），表達(dá)差異最顯著（P＜0.001）。該circRNA由NFIC基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)，因此命名為circNFIC。

圖2 血清外泌體中差異化表達(dá)的circRNA

2.3 circNFIC與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

根據(jù)circNFIC在肝癌患者血清中的中位表達(dá)值來(lái)區(qū)分高表達(dá)或低表達(dá)。circNFIC的異常高表達(dá)肝癌患者更易發(fā)生肝外轉(zhuǎn)移和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，并且腫瘤體積更大。而血清circNFIC表達(dá)水平與年齡、性別、AFP水平、肝硬化、BCLC分期和分化程度無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性（P＞0.05），見(jiàn)表1。Kaplan-Meier生存分析（圖3）發(fā)現(xiàn)circNFIC高表達(dá)組患者的總體生存期顯著低于circNFIC低表達(dá)組患者[（24.35±3.09）個(gè)月vs（31.49±2.95）個(gè)月，P＜0.05]。

圖3 不同circNFIC表達(dá)水平的肝癌患者生存曲線

表1 肝癌臨床病理特征與circNFIC表達(dá)水平的關(guān)系（n=62）

3 討論

越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，外泌體不僅是細(xì)胞的“垃圾箱”，而且是不同細(xì)胞之間相互作用的重要信號(hào)介質(zhì)[7-8]。外泌體的發(fā)現(xiàn)提供了一種新的細(xì)胞間通訊方法，能夠參與人體內(nèi)多種生理和病理過(guò)程，如血管生成、免疫反應(yīng)、抗原提呈、細(xì)胞分化、腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。外泌體作為納米級(jí)的生物囊泡，攜帶著特定的蛋白質(zhì)和RNA序列，充當(dāng)著細(xì)胞間信息交換的信使，從而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞間的通信。肝癌細(xì)胞分泌的外泌體顯著高于正常肝細(xì)胞，而且肝癌細(xì)胞對(duì)外泌體具有精確的靶向機(jī)制，這表明外泌體在肝癌的形成和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[9-11]。外泌體中存在大量的circRNA，研究者通過(guò)全基因組RNA測(cè)序（RNA seq）分析，鑒定了來(lái)自肝癌外泌體的circRNA轉(zhuǎn)錄物[12]，結(jié)果表明，circRNAs在外泌體中的濃度比親本細(xì)胞至少高2 倍，為肝癌中circRNAs的功能研究提供了新的思路。本研究通過(guò)高通量circRNA芯片技術(shù)篩查肝癌患者血清外泌體中circRNA的差異化表達(dá)，通過(guò)與健康志愿者血清樣本的比較，發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清外泌體中存在顯著差異化表達(dá)的circRNA共2 094 條，其中表達(dá)上調(diào)1 168的條，表達(dá)下調(diào)的926條，初步證實(shí)外泌體circRNA的表達(dá)變化可能與肝癌的疾病進(jìn)程具有密切關(guān)系。

考慮到檢測(cè)樣本量和高通量芯片篩選結(jié)果可能存在的偏差，并且外泌體circRNA作為信號(hào)傳遞分子，最終在肝臟組織中發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控作用，因此，本研究進(jìn)一步選擇了表達(dá)差異最顯著的hsa_circ_0002018（circNFIC）在62例肝癌患者血清外泌體樣本和62 例健康志愿者血清外泌體樣本中進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)hsa_circ_0002018（circNFIC）在肝癌患者血清中存在顯著的高表達(dá)（P＜0.001）。hsa_circ_0002018 作為一條全新的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA分子，基因組位于chr19:3449011-3452664，轉(zhuǎn)錄本為NM_205843，目前關(guān)于hsa_circ_ 0002018（circNFIC）在肝癌中的生物學(xué)功能未見(jiàn)研究報(bào)道，其在肝癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移調(diào)控及早期診斷中的作用機(jī)制仍需要深入的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清circNFIC的異常高表達(dá)與腫瘤≥5 cm（P=0.003）、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移（P=0.034）和肝外轉(zhuǎn)移（P=0.019）顯著相關(guān)，而與年齡、性別、AFP水平、肝硬化、BCLC分期和分化程度無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性（P＞0.05）。采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)circNFIC高表達(dá)組患者的生存時(shí)間顯著低于circNFIC低表達(dá)組患者（P＜0.05）。也有研究證實(shí)肝癌組織中的環(huán)狀circRNA ZKSCAN1表達(dá)下調(diào)，與肝硬化、浸潤(rùn)程度以及TNM分期等病理特征具有顯著的相關(guān)性[13]。Shang等[14]報(bào)道，HCC患者的腫瘤組織中hsa-circ-0005075上調(diào)，并參與調(diào)控HCC的發(fā)生發(fā)展。而hsa-circ-0001445在肝癌組織中的相對(duì)含量降低，可作為肝切除術(shù)后肝癌患者的總生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。

綜上所述，肝癌外泌體中差異化表達(dá)的circRNA可作為監(jiān)測(cè)和靶向腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，其中circNFIC有望成為干預(yù)肝癌進(jìn)展的潛在靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步的探索和驗(yàn)證。