維生素 K 1聯合 X射線對非小細胞肺癌細胞存活能力的影響

司少艷，秦亞亞，王宗燁，宋淑軍#

戰略支援部隊特色醫學中心1綜合基礎研究室，2放療科，北京 100101

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，世界衛生組織國際癌癥研究機構發布的統計數據顯示，2020年全球肺癌新發病例220萬，僅次于乳腺癌，死亡病例180萬，居惡性腫瘤死亡例數第一；2020年中國肺癌新發病例和死亡病例均居惡性腫瘤首位，分別為82萬和71萬[1]。美國癌癥協會報道非小細胞肺癌占全部肺癌的80%～85%[2]。放療是肺癌的重要治療手段，特別是局部晚期非小細胞肺癌、轉移肺癌不能進行其他治療時，放療顯得尤為重要。然而，放療也存在一定的不良反應，許多患者會逐漸產生放療抵抗或對放療不敏感。因此，為了提高療效、減輕不良反應或減少放療抵抗，開發一些與放療具有協同作用的藥物可能會減少不良反應或增加放療敏感性，對改善腫瘤患者的臨床預后具有非常重要的意義。但大多數藥物存在不良反應，因此近年來人們越來越關注無不良反應的天然食品。維生素是維持人體正常功能所必需的營養素，在新陳代謝中發揮著重要作用。維生素K（vitamin K，VK）是一種脂溶性維生素，于1929年首次被發現[3]，是參與凝血過程的一種必需因子，天然形式的VK1和VK2及人工合成的VK3、VK4和VK5均含有2-甲基-1，4-萘醌環結構[4]。VK1屬于天然營養素，主要存在于綠色蔬菜和植物中，又稱葉綠醌，是VK在食物中的主要存在形式，很少產生不良反應，對多種人類腫瘤細胞表現出一定的抗腫瘤特性[4-5]，而且可以增強索拉非尼對結腸癌細胞的抑制作用[6]。目前有關VK1對腫瘤放療影響的研究尚未見報道，本研究探討VK1聯合X射線對非小細胞肺癌細胞存活能力的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細胞肺癌細胞A549由美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）提供，細胞培養基RPMI-1640購自美國GE醫療生命科學部，胎牛血清由上海依科賽生物制品有限公司提供，Axesse醫用電子直線加速器購自瑞典Elekta公司，瑞氏-姬姆薩染液購自北京雷根生物技術有限公司，VK1購自江蘇華陽制藥有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養應用改良的RPMI-1640培養基培養細胞，培養基中含10%胎牛血清、青霉素（100 IU/ml）和鏈霉素（100 IU/ml），于 37 ℃、5%CO2培養箱中培養，每2～3天換液1次，取對數生長期細胞進行傳代接種及后續實驗。

1.2.2 細胞照射采用瑞典Elekta公司生產的Axesse醫用電子直線加速器，室溫下6MV-X射線照射細胞，照射源軸距為100 cm。照射劑量為2 Gy，劑量率為4 Gy/min。對照組細胞不進行實際照射，但同樣運至照射地點。

1.2.3 細胞集落形成實驗將對數生長期的A549細胞稀釋成單細胞懸液，然后接種于6孔板中，每孔400個細胞，待細胞貼壁后，換成含有0、6.25、12.50、25.00 μg/ml VK1的培養基處理細胞，分別作為對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組，1天后進行X射線照射（每個VK1劑量組均設未照射對照組），單次照射總劑量為2 Gy。然后把細胞置于培養箱中繼續培養，應用含原相同濃度VK1的培養基每2～3天換液1次，藥物處理時間為8天，于照射后第8天（照射后7天整），應用4%多聚甲醛固定細胞，然后應用瑞氏-姬姆薩染液進行染色，顯微鏡下觀察細胞，對≥50個細胞的細胞團（集落）進行計數，集落形成效率=每孔集落數量/每孔接種細胞數量×100%，存活分數=實驗組集落數量（/該組每孔細胞接種數×未照射對照組集落形成效率）×100%。

1.2.4 藥物相互作用的評價根據Cohen等[7]的方法計算藥物相互作用系數（coefficient of drug interaction，CDI），計算公式：CDI=AB（/A×B），其中AB為VK1與射線聯合作用后細胞的存活率，A為單獨VK1處理后細胞的存活率，B為單獨射線作用后細胞的存活率。CDI=1時兩者為相加作用，CDI＞1時兩者為拮抗作用，CDI＜1時兩者為協同作用，CDI＜0.7時兩者為顯著的協同作用。但一般為了補償生物實驗的自然偏差，相加作用的判斷可擴展至0.9≤CDI≤1.1。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。繪制劑量-反應曲線，計算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VK 1對 A549細胞集落形成能力的影響

不同濃度VK1處理后A549細胞集落數量明顯不同（圖1）。VK1高濃度組、中濃度組、低濃度組、對照組細胞集落數量分別為（50.0±8.7）、（158.7±5.2）、（201.0±3.8）、（188.7±3.4）個。其中高濃度組細胞集落數量最少，僅為對照組的26.5%，中濃度組次之，為對照組的84.1%，而低濃度組與對照組細胞集落數量無明顯差異。高濃度組細胞集落數量低于中濃度組、低濃度組、對照組，且中濃度組細胞集落數量低于對照組和低濃度組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。VK1能夠使A549細胞集落數量減少，且呈劑量依賴性，IC50為20.22 μg/ml。

圖1 不同濃度VK 1處理后 A549細胞集落數量

2.2 VK 1與 X射線對 A549細胞存活分數的影響

對于未照射X射線的A549細胞，VK1中濃度組和高濃度組細胞存活分數均低于對照組和低濃度組，高濃度組細胞存活分數低于中濃度組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。對于照射X射線的A549細胞，低濃度組、中濃度組和高濃度組細胞存活分數均低于對照組，中濃度組和高濃度組細胞存活分數均低于低濃度組，高濃度組細胞存活分數低于中濃度組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。照射X射線的各組細胞存活分數均低于未照射X射線的各組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）。X射線（2 Gy）照射后A549細胞集落數量明顯減少，在對照組中，與未照射X射線的細胞比較，照射X射線的細胞存活分數下降了44.5%；低濃度、中濃度和高濃度VK1與X射線聯合作用后細胞存活分數較單獨X射線照射分別下降了39.5%、72.1%和98.1%，較未照射X射線的對照組分別下降了66.4%、84.5%和98.9%，其下降程度與VK1濃度呈劑量依賴性。與未進行X射線處理的細胞比較，低濃度、中濃度和高濃度VK1與X射線聯合作用后細胞存活分數分別下降了68.5%、71.5%和96.0%，其下降程度與VK1濃度呈劑量依賴性。（表1）

表1 VK 1與 X射線對 A549細胞存活分數的影響

2.3 不同濃度VK 1與 X射線聯合作用的CDI

低濃度、中濃度、高濃度VK1與X射線聯合作用的CDI分別為0.57、0.33和0.07，均明顯小于0.7。

3 討論

體外集落或克隆形成實驗于60多年前由Puck和Marcus[8]建立，是檢測單個細胞在體外增殖并形成細胞群體（50及以上的細胞團稱為一個集落）的能力，該技術是評價腫瘤細胞存活和增殖能力的良好方法[9]，可以用來評估各種治療方法的細胞毒性效應，被廣泛用于檢測化學藥物或輻射對腫瘤細胞的抑制效果[10-11]，與其他體外生物活性實驗相比，集落形成實驗更為敏感[12]。已有研究證明，集落形成實驗結果與臨床藥物的實際反應具有一定的相關性[13]。本研究應用體外集落形成實驗評估VK1與X射線對非小細胞肺癌細胞A549存活能力的影響。

VK屬于脂溶性維生素，通常被認為是血液凝固的關鍵因素，近年來在體內試驗和體外實驗中均觀察到各種VK的抗腫瘤作用。動物實驗結果顯示，給荷肝癌大鼠腹腔內注射VK3，每周1次，每次10 mg，持續給藥4周，其存活期從對照組的17天延長至治療組的60天[14]。研究者對皮下肉瘤模型小鼠進行VK2治療，結果顯示，靜脈或灌胃兩種給藥方式均可顯著抑制腫瘤生長[15]。在臨床試驗中，晚期肝癌患者服用VK3后，17%的患者腫瘤體積縮小，而且患者的平均生存時間也有所增加[16]。在一項24 000多人參與的調查研究中，通過10年以上的隨訪調查發現，VK2能夠在一定程度上降低惡性腫瘤病死率，膳食VK2攝入量與男性肺癌和前列腺癌的發生風險呈顯著負相關，但未發現其與VK1的攝入量具有相關性[17]。然而對美國人群的一項調查研究并未發現食物中VK（VK1、VK2和總VK）的攝入量與全部前列腺癌或晚期前列腺癌的發生有關[18]。一項10萬多人參與的調查研究發現，飲食中VK1和二氫VK1的攝入量與胰腺癌的發生風險呈負相關，而未發現VK2攝入量與胰腺癌具有相關性[19]。以上調查結果不一致可能與研究方式、地區、人種以及腫瘤類型不同有關。但多數的體外實驗顯示VK對多種類型的腫瘤細胞具有抗腫瘤特性[5，20]，VK3和 VK5能夠抑制白血病細胞增殖，誘導白血病細胞凋亡[21]。VK2對多種肺癌細胞系，包括小細胞癌、腺癌、鱗狀細胞癌以及大細胞癌的生長均具有劑量依賴性抑制作用，其抑制效果與肺癌細胞系的組織類型無關[22]。VK1可以誘導人類胃癌和結腸癌細胞凋亡并抑制細胞增殖，而且不同的腫瘤細胞對VK的敏感性不同，結腸癌細胞比胃癌細胞對VK1的反應更明顯[23]。目前，有關VK1對非小細胞肺癌A549細胞的影響尚未見報道。本研究結果顯示，VK1呈劑量依賴性抑制A549細胞集落形成，高濃度VK1（25.00 μg/ml）單獨處理細胞即可以抑制近75%的細胞集落形成，提示VK1在體外對A549細胞的生長及存活具有明顯的抑制作用。這為進一步研究VK1的抗腫瘤作用提供了依據。本研究中VK1對A549細胞的IC50為20.22 μg/ml（相當于55.5 μmol/L），明顯小于以往報道的6～9 mmol/L[20]，造成這種差異的原因可能與采用的實驗方法不同有關，本研究中采用的集落形成實驗比其他細胞存活實驗更敏感[12]。而且研究的腫瘤細胞種類不同，不同的腫瘤細胞對VK1的敏感性不同。此外，藥物處理時間不同也會影響IC50，本研究中藥物處理時間為8天，細胞一直處于含有VK1的培養基中，因此，如果臨床應用VK1協助治療腫瘤，在治療期間持續維持體內VK的充足水平可能也是影響治療效果的重要因素。

VK1作為一種天然產物，具有一定的抗腫瘤活性，近年來研究顯示VK1與化療藥物索拉非尼聯合使用可以明顯增強索拉非尼對人類腫瘤細胞（如肝癌、胰腺癌、結腸癌以及惡性膠質瘤細胞）的抗腫瘤作用，VK1可以增強化療藥物對腫瘤細胞存活、遷移、增殖的抑制作用以及對腫瘤細胞凋亡的促進作用[24]。因此，VK1有可能是放療增效作用的潛在制劑。本研究結果顯示，VK1可以呈劑量依賴性增強2 Gy照射對A549細胞存活的抑制作用，雖然低劑量VK1單獨處理對細胞的集落形成能力沒有抑制作用，但低劑量VK1與X射線聯合作用可以使X射線對細胞的抑制能力提高近40%，因此，VK1有可能成為放療潛在的增敏劑。而高劑量VK1的抑制作用明顯提高，較單獨照射組的抑制作用提高98%以上，接近1倍，說明VK1對X射線具有增效作用。而且兩者聯合使用較單獨使用的抑制效果更明顯，說明兩者可能具有協同作用。曾有研究報道，VK1與索拉非尼聯合使用對肝癌細胞的遷移和增殖具有協同抑制作用[25]。

兩種藥物或治療方法聯合使用時，其相互作用結果的判斷可以通過CDI進行評估[7]。CDI＜1時兩者為協同作用，CDI＜0.7時兩者為顯著的協同作用，本研究結果顯示，低濃度、中濃度、高濃度VK1與X射線聯合作用的CDI分別為0.57、0.33和0.07，均明顯小于0.7，說明VK1與X射線之間的相互作用為顯著的協同作用，而不是簡單的加性效應。本研究為VK1和X射線聯合治療非小細胞肺癌提供了一定的實驗依據。在放射治療期間適當補充VK1，使體內VK1處于充足狀態，可能會增強放射治療對腫瘤細胞的殺傷效果。

綜上所述，VK1對非小細胞肺癌細胞具有劑量依賴性抑制作用，其與X射線聯合使用對非小細胞肺癌細胞具有協同抑制作用。然而，VK1增強X射線療效的機制目前還不清楚，本研究僅對A549細胞的集落形成能力進行了研究，VK1對腫瘤細胞其他生物學特性（如細胞周期、凋亡、自噬以及增殖）的影響同樣重要，也需要進行研究。此外，體外培養時細胞的增殖、生長以及生命力的體現均與體內環境有明顯差異，因此，體內試驗也有待進一步開展。