血管生成因子、程序性死亡受體 1及其配體在肺腺癌中的表達及與患者預后的關系

高翔，龐瓊，王瑩

漢中市中心醫院腫瘤內科，陜西 漢中 723000

隨著社會經濟的快速發展，肺癌發病率、致死率呈逐年上升趨勢，發病率居惡性腫瘤首位[1]。流行病學資料顯示，肺癌發病率居中國男性惡性腫瘤首位，居女性惡性腫瘤第二位[2]。肺癌主要包括小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC占85%[3]，肺腺癌是NSCLC的主要類型，其比例在亞洲人群中呈增長趨勢。盡管目前醫學技術明顯進步，但肺腺癌患者的預后仍無明顯改善，術后患者5年生存率仍較低[3]，因此，尋找一種評估患者預后的特異性指標十分重要。近年來，免疫靶向治療已廣泛應用于惡性腫瘤的治療中，其中免疫檢查點程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱 PD-1）/程序性死亡受體配體1（programmed celldeath 1ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）通路作為關鍵靶點之一為肺腺癌的治療提供了新思路[4-6]，但關于PD-1/PD-L1在腫瘤患者預后中的臨床意義尚存在爭議。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）在腫瘤細胞中過表達，二者相互作用促進“血管化腫瘤”的形成。VEGFA作為VEGF家族成員之一，主要通過與VEGFR2結合參與腫瘤的發生發展過程[7-9]。基于此，本研究探討VEGFA、VEGFR2、PD-1/PD-L1在肺腺癌中的表達及與患者預后的關系，旨在為臨床肺腺癌的治療及預后評估提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2018年1月在漢中市中心醫院行手術治療的肺腺癌患者。納入標準：①年齡＞18周歲，均接受手術切除；②病理學檢查證實為肺腺癌；③既往未接受靶向治療、放療、化療或其他藥物治療；④未合并其他惡性腫瘤；⑤臨床資料完整。排除標準：①合并心、肝、腎等嚴重疾病；②妊娠期或哺乳期女性。依據納入和排除標準，本研究共納入126例肺腺癌患者，作為研究組，其中男65例，女61例；年齡54～63歲，平均（58.9±4.4）歲；國際肺癌研究協會（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）第七版肺癌TNM分期[10]：Ⅰ～Ⅱ期81例，Ⅲ期45例。選取同期在漢中市中心醫院體檢的126例健康體檢者，作為對照組，其中男65例，女61例；年齡54～65歲，平均（58.4±4.7）歲。兩組受試者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

研究組患者于術前24 h抽取空腹靜脈血5 ml，對照組受試者于體檢當天抽取清晨空腹靜脈血5 ml，3000 r/min離心5 min，分離血清，采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清VEGFA、VEGFR2、PD-1及PD-L1水平。

術后收集肺腺癌患者切除的肺腺癌組織，于5%多聚甲醛溶液中保存，制成蠟塊，4 μm切片，采用免疫組化法檢測肺腺癌組織中VEGFA、VEGFR2、PD-1及PD-L1蛋白的表達情況。結果判定：于高倍鏡下隨機選取5個視野，每個視野選取100個腫瘤細胞，細胞呈棕黃色或棕褐色染色、陽性細胞所占比例≥5%判定為陽性。由兩名中級職稱以上病理醫師通過雙盲法進行結果判斷，若結果不一致則由第3名具有副高級職稱的醫師進行確定。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC），評估VEGFA、VEGFR2、PD-1及PD-L1對肺腺癌患者預后的評估價值；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VEGFA、VEGFR 2、PD- 1及PD-L 1表達情況的比較

研究組患者血清VEGFA、VEGFR2、PD-1及PD-L1水平均明顯高于對照組受試者，差異均有統計學意義（P＜0.01）（表1）。肺腺癌患者肺腺癌組織中VEGFA、VEGFR2、PD-1及PD-L1蛋白陽性表達率分別為 43.65%（55/126）、42.86%（54/126）、46.83%（59/126）、42.86%（54/126）。

表1 兩組受試者血清VEGFA、VEGFR 2、PD- 1及PD-L 1水平的比較

2.2 不同預后肺腺癌患者血清VEGFA、VEGFR 2、PD- 1及PD-L 1水平的比較

術后采用電話隨訪及門診隨訪的方式對肺腺癌患者進行為期1年的隨訪，隨訪時間截至2019年1月，126例肺腺癌患者生存94例，死亡32例，死亡患者血清VEGFA、VEGFR2、PD-1及PD-L1水平均明顯高于生存患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 不同預后情況肺腺癌患者血清VEGFA、VEGFR 2、PD- 1及PD-L 1水平的比較

2.3 不同臨床特征肺腺癌患者肺腺癌組織中VEG-FA、VEGFR 2、PD- 1及PD-L 1蛋白表達情況的比較

不同性別、年齡、吸煙情況、腫瘤大小肺腺癌患者肺腺癌組織中VEGFA、VEGFR2、PD-1及PD-L1蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。存在淋巴結轉移的肺腺癌患者肺腺癌組織中VEGFA、VEGFR2、PD-1及PD-L1蛋白陽性表達率均高于無淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（χ2=8.762、12.549、12.606、12.549，P＜0.05）；臨床分期為Ⅲ期的肺腺癌患者肺腺癌組織中VEGFA、VEGFR2、PD-1及PD-L1蛋白陽性表達率均高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統計學意義（χ2=9.815、10.719、4.879、8.400，P＜0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征肺腺癌患者肺腺癌組織中VEGFA、VEGFR 2、PD- 1及PD-L 1蛋白的表達情況（ n=126）

2.4 VEGFA、VEGFR 2、PD- 1及PD-L 1水平對肺腺癌患者預后的預測價值

VEGFA、VEGFR2、PD-1及PD-L1預測肺腺癌患者預后的AUC分別為0.823、0.836、0.860、0.833，均較高。（圖1、表4）

圖1 VEGFA、VEGFR 2、PD- 1及PD-L 1預測肺腺癌患者預后的ROC曲線

表4 VEGFA、VEGFR 2、PD- 1及PD-L 1水平對肺腺癌患者預后的預測價值

3 討論

PD-1作為CD28/細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白 4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）家族成員之一，主要表達于活化的單核細胞、B細胞、T細胞及樹突狀細胞中。由于PD-1與細胞凋亡密切相關，因此稱為程序性死亡受體1[11]。PD-1是一種重要的免疫檢查點受體，在免疫逃逸機制中發揮著重要作用。PD-L1作為PD-1的配體，可表達于T細胞、B細胞中，同時在腫瘤細胞及腫瘤基質細胞中也呈過表達，提示可能參與了腫瘤的發生發展過程[12-13]。研究表明，正常機體中的PD-1/PD-L1被激活時，可抑制自身免疫反應對周圍正常組織造成的損傷，同時還可避免發生自身免疫性疾病[14]。研究顯示，腫瘤細胞侵襲時，PD-1/PD-L1將被激活，進而消耗抗原特異性T細胞，介導腫瘤細胞逃避免疫殺傷，并促進免疫細胞的增殖[15]。研究證實，PD-1/PD-L1信號通路在乳腺癌、肝癌、腎癌等實體瘤及多種造血系統腫瘤中呈過表達，且表達水平與患者的預后密切相關[16-17]。本研究結果顯示，與健康體檢者相比，肺腺癌患者血清PD-1及PD-L1水平明顯更高，而免疫組化結果顯示，126例患者中，PD-1及PD-L1的陽性表達率分別為46.83%、42.86%。本研究進一步探討PD-1、PD-L1與肺腺癌患者臨床特征的關系，結果顯示，存在淋巴結轉移、臨床分期為Ⅲ期肺腺癌患者肺腺癌組織中PD-1及PD-L1蛋白的陽性表達率更高，這可能與免疫逃逸機制及疾病嚴重程度有關，但具體的機制仍需后續研究進行探討。

新生血管生成是腫瘤發生發展的基礎條件之一，而腫瘤微環境缺氧是血管生成的誘發因素之一。研究發現，機體處于低氧條件時，缺氧誘導因子可誘導促進血管生成因子的表達，進而促進新生血管生成及新的循環通路的建立[18]。VEGFA為VEGF家族成員之一，可與VEGFR2相互作用促進腫瘤新生血管生成，此外，二者聯合還可促進細胞自噬，刺激VEGFA的表達，形成惡性循環。此外，還有研究表明，VEGFA還可作用于新生血管上的核素進而促進細胞增殖，并可介導磷酸化蛋白磷酸酶2促進內皮細胞的增殖[19]。研究發現，VEGFA和VEGFR2可在多種實體瘤中過表達，并可能作為預后評估的指標之一[20]。本研究結果顯示，與健康體檢者相比，肺腺癌患者血清VEGFA、VEGFR2水平明顯升高，且VEGFA、VEGFR2蛋白的陽性率分別為43.65%、42.86%，且存在淋巴結轉移、臨床分期為Ⅲ期肺腺癌患者肺腺癌組織中VEGFA、VEGFR2蛋白的陽性表達率更高。

此外，本研究結果顯示，VEGFA、VEGFR2、PD-1及PD-L1預測肺腺癌患者預后的AUC分別為0.823、0.836、0.860、0.833，均較高，且上述指標具有易獲得、檢測簡便的特點，也為臨床肺腺癌患者預后的預測提供了新思路。

綜上所述，肺腺癌患者肺腺癌組織中VEGFA、VEGFR2、PD-1及PD-L1表達明顯上調，且對患者預后有一定的評估價值。但本研究納入的樣本量較小，未動態觀察各指標變化情況，仍需后續研究進一步證實。