基于網絡藥理學探討紅核婦潔洗液抗感染的作用機制*

饒鴻宇，李沛波，諶攀，史志恒，蘇薇薇

廣東省中藥上市后質量與藥效再評價工程技術研究中心/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室/中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275

陰道感染，常表現為分泌物異常、瘙癢和異味等，是臨床最常見的婦科疾病之一，降低了女性的生活質量。目前，臨床治療仍以抗生素為主，然而抗生素的長期應用增強了細菌的耐藥性，容易誘導耐藥菌的出現，另外抗菌藥物的大量使用還會破壞陰道菌群穩態，導致疾病反復。傳統中藥經過長期的臨床實踐遴選，具有不良反應小、耐藥率低等優勢，具有良好的開發前景，但由于其作用機制尚不明確，限制了其應用。

紅核婦潔洗液收錄于《新藥轉正標準中藥第33 冊》，是用山楂核制得的外用洗劑，多項研究發現其對白色念珠菌等生殖道致病菌均有良好的殺滅功效，可用于各種原因引起的女性陰道感染，還能用于預防產后感染和會陰傷口的消毒等［1-5］。本團隊研究了紅核婦潔洗液的化學成分，發現了包括2，6-二甲氧基苯酚在內的多個具有良好抑菌活性的酚類化合物，但其他抗感染機制仍有待研究［6-8］。

中藥網絡藥理學整合了包括醫學、化學和生物學在內的多方面數據，運用計算機技術建立預測模型，可以從分子、細胞、組織等多個層面預測藥物的作用機制，更好地揭示中藥的整體作用，為多組分中藥的機制研究提供了新的方向［9-12］。本研究基于網絡藥理學方法，首次探討了紅核婦潔洗液預防和治療感染性疾病的作用機理，為紅核婦潔洗液的臨床應用提供了支撐。

1 方 法

1.1 化學成分的收集

基于氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術，本團隊對紅核婦潔洗液的物質組成進行了系統的研究，共確證和指認了包括酚類和醛酮類等在內的92 個化合物，其中多個酚類化合物展現出了良好的抗菌活性，揭示了紅核婦潔洗液的化學成分［6-7］。

1.2 交集靶點的確定及藥材-活性成分-交集靶點網絡的構建

在DisGeNET（http：//www. disgenet. org/）中對“infection”進行搜庫，得到與感染性疾病相關的靶基因名，同時將紅核婦潔洗液所有化合物的結構導入TCMSP（http：//tcmspw. com/）、SwissTarget-Prediction（http：//www. swisstargetprediction. ch/）和CTD（https：//ctdbase. org/），明確紅核婦潔洗液的全部潛在靶標基因［8］。搜集兩者的交集數據，并制作維恩圖，明確紅核婦潔洗液發揮抗感染功效的潛在靶基因。再運用Cytoscape3.7.2對上述相關的靶點和對應化合物進行網絡可視化處理，同時研究該網絡的特征。

1.3 交集靶點通路分析和功能分析

為進一步挖掘靶基因的功能，將“交集數據”導入DAVID v6.7（https：//david. ncifcrf. gov/），選定研究目標為人種（homo sapiens），分析其通路信息（KEGG，kyoto encyclopedia of genes and genomes）和生物學功能（GO，gene ontology），闡明紅核婦潔洗液的作用機制［8］。

2 結 果

2.1 成分收集和靶點篩選

從DisGeNET 共獲得491個抗感染相關的靶點，與搜集到的1 056 個紅核婦潔洗液潛在作用靶點整合后，得到紅核婦潔洗液抗感染的相關靶點143個（圖1），用于后續網絡構建。

圖1 紅核婦潔洗液成分潛在靶點與感染性疾病靶點Venn圖Fig.1 Venn diagram of HHFJL potential targets and infection disease targets

2.2 網絡分析

將藥材-成分-靶點構建的網絡圖導入Cytoscape 進行拓撲分析，發現該網絡共有227 個節點（包括84 個成分和143 個交集靶點），1 170 條邊（圖2）。在這些靶點中，Degree 排名靠前的靶點依次為PARP1、PTGS1、ESR1、IDO1、NOS2、ALOX5、EGFR、PTGS2、HDAC6、JAK1、PTPRC、PIK3CA、TLR9、MIF 和PTPN22，為紅核婦潔洗液潛在的作用靶點。Degree 排名靠前的成分依次是Eugenol（丁香酚）、2-methoxy-4-（1-propenyl）-Phenol（異丁香酚）、2-methoxy-Phenol（愈創木酚）、Catechol（鄰苯二酚）和3-methyl-1，2-Benzenediol（3-甲氧基鄰苯二酚），是紅核婦潔洗液發揮功效的潛在化合物。

圖2 藥材-成分-交集靶點網絡圖Fig.2 The herb-component-key target network

2.3 交集靶點通路分析和功能分析

由圖3 可見，KEGG 分析（P< 0.05）共篩選出包括TNF 信號通路、TLR 信號通路、NF-kappa B 信號通路和NOD-like 受體信號通路等信號通路合計107條（P值越小，富集程度越高）。GO功能分析則關聯到715 個條目（P<0.05），其中與脂多糖介導的信號通路、凋亡過程負調控、炎癥反應、缺氧反應等生物過程相關的條目有570個，與酶結合、蛋白質結合、轉錄因子結合等分子功能相關條目有93 個，與細胞質基質、細胞外空間、細胞表面等細胞組成相關條目有52個（圖4）。

圖3 紅核婦潔洗液交集靶點KEGG通路富集分析結果Fig.3 Pathway enrichment analysis of the key targets

圖4 紅核婦潔洗液交集靶點GO富集分析結果Fig.4 GO enrichment analysis of the key targets

3 討 論

縱觀人類疾病發展史，感染性疾病是造成人類流行病的主要原因之一。隨著青霉素的問世，抗菌藥在一線抗感染過程中一直扮演著十分重要的角色。然而抗菌藥的大量使用加劇了細菌的耐藥趨勢，部分菌株的耐藥率已超過60%，甚至出現了對多種抗生素都具有耐藥性的“超級細菌”，給公共醫療系統造成了巨大的負擔［13］。傳統中藥經過長期的臨床實踐遴選，具有扎實的臨床應用基礎，但其體外抑菌能力距離現代醫學界定的抗感染藥物標準尚存在著差距。由此可見，傳統的最小抑菌濃度評價體系在評估中藥抗感染功效時存在局限性，必須運用更加合理評判體系去分析中藥的抗感染功效。

多項臨床研究發現紅核婦潔洗液可用于治療需氧菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、非特異性陰道炎和陰道瘙癢等多種婦科感染性疾病［2-3］。體外研究數據則表明紅核婦潔洗液原液能抑制紅色毛癬菌、犬小孢子菌和念珠菌等多種皮膚淺表真菌的生長，同時紅核婦潔洗液中的2，6-二甲氧基苯酚和5-叔丁基鄰苯三酚等物質還可以有效殺滅陰道加德納氏菌、白色念珠菌和大腸桿菌等生殖道致病菌［4-6］。由此可見，紅核婦潔洗液可抑制多種微生物的生長，有利于感染性疾病的治療和傷口的消毒等。

本研究采用網絡藥理學解析了紅核洗液抗感染的有效成分，發現在92 個化合物中，包括愈創木酚、2，6-二甲氧基苯酚和5-叔丁基鄰苯三酚等64個化合物均與10 個以上靶點相關，其中排名最高的是丁香酚，為55 個。丁香酚可作用于細胞質膜表面，影響細胞膜的通透性和流通性，導致致病菌與宿主細胞的黏附減少，降低病原菌的致病性，還能影響細胞內容物的轉運，促進鉀離子和ATP的流失；此外，丁香酚還能激活細胞內的活性氧，誘導氧化應激，促使細菌和真菌的細胞凋亡［14-15］。Patrícia 等［16］對酚類化合物的抗菌活性進行了系統研究，發現愈創木酚對銅綠假單胞菌、大腸桿菌和金葡菌等均展現出良好的抑制功效。Yang 等［17］發現2，6-二甲氧基苯酚具有良好的抗菌和抗氧化活性，可應用于滅菌制劑的開發。楊梅等［18］運用DPPH 實驗研究艾葉燃燒物的抗氧化活性，結果發現其中的5-叔丁基鄰苯三酚可以清除自由基，具有良好的抗氧化能力。由此可見，紅核洗液中的丁香酚、愈創木酚和2，6-二甲氧基苯酚等在對抗病原菌入侵、抑制病原菌生長和清除體內自由基等方面發揮了良好的功效，可以減輕機體的感染癥狀。

在“成分-靶點”研究中，本研究發現了紅核婦潔洗液的潛在作用靶點中有43 個靶基因與10 個以上化合物相關，占30.07%，評分高低依次為PARP1、PTGS1、ESR1 和IDO1 等。PRAP1 是一種與DNA 損傷和細胞凋亡密切相關的DNA 修復酶，諸多研究表明PARP1 在病毒與宿主細胞結合過程中發揮著重要的作用［19-20］。Wang 等［21］發現PARP1 還可以抑制IRF1 的轉錄，影響Jurkat 細胞對感染的免疫應答。PTGS 是催化前列腺素合成的關鍵酶之一，大量研究表明PTGS1（又名COX1）在機體炎癥反應和免疫調節過程中扮演著十分重要的角色［22-24］。ESR1 可介導雌激素反應，有研究發現ESR1 的激活與ZIKV 病毒的復制和登革熱病毒誘導的細胞自噬具有一定的相關性［25-26］。此外，Laura 等［27］發現ESR1 還可以促進中性粒細胞遷移至陰道腔，對抗白色念珠菌等致病菌的入侵，降低陰道感染的風險。Noa 等［28］對沙眼衣原體感染進行研究，發現IDO1 可調節機體免疫反應，且該調節作用不受干擾素分泌的影響。因此，紅核婦潔洗液可從抑制細菌、病毒感染和調節機體免疫功能等途徑改善機體狀態，發揮抗感染作用。

在對紅核婦潔洗液作用的靶基因分析過程中，本研究發現包括脂多糖信號通路、NF-kappa B 信號通路、炎癥反應和缺氧反應等多個信號通路和生物過程可能與紅核婦潔洗液的抗感染治療密不可分。做為革蘭氏陰性菌細胞壁重要的組成成分，脂多糖可通過激活TLR4 誘導免疫反應，促進下游的NF-κB 和IRF3 等多條信號通路的活化，加重機體的氧化應激和炎癥反應［29］。TNF 家族是與炎癥刺激緊密相連的細胞因子，被激活的TNFR可以促進IL-1、IL-6 和IL-10 等細胞因子的釋放，還能激活與細胞凋亡相關的MAPK-JNK 和NF-κB 等多條信號通路，激活磷脂酶A2 和5-脂氧合酶等多個蛋白，加重機體的炎癥反應［30］。有研究表明藥物和細胞可通過影響LPS 和TNF 信號通路等，降低TNF-α、IL-1β 和IL-6 等細胞因子的含量，減輕炎癥反應，促進機體的恢復［31-33］。與此同時，Yu等［34］發現能量代謝異常可影響巨噬細胞分化，加重機體感染癥狀。此外，Arnab 等［35］指出白色念珠菌等病原菌可通過調節局部免疫，適應缺氧環境，完成定植，增加感染復發的風險。因此，紅核婦潔洗液可通過減輕炎癥反應和氧化應激，改善細胞缺氧等方面，促進感染患者的痊愈。

綜上所述，紅核婦潔洗液可通過多靶點多通路抑制病原菌的入侵和繁殖，還能調節免疫應答、減輕炎癥反應、緩解氧化應激損傷等，促進感染癥狀的消退和患者的痊愈。本研究剖析了紅核婦潔洗液的作用靶點和信號通路，為紅核婦潔洗液在治療感染性疾病方面的應用提供了合理的解釋。