基于16S rDNA高通量測(cè)序分析循環(huán)水養(yǎng)魚(yú)微生物群落結(jié)構(gòu)研究

曲 夢(mèng)，江艷華，桂彬彬，3，教 楊，3，王聯(lián)珠，崔正國(guó)，譚志軍，2，3，姚 琳

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034)

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(RAS)是一種提高水產(chǎn)品品質(zhì)、高效利用水資源的養(yǎng)殖方式，具有環(huán)境可控、節(jié)水、高效、環(huán)保和安全等優(yōu)點(diǎn)。解析RAS中的微生物種群結(jié)構(gòu)，對(duì)于保持RAS 內(nèi)部的生態(tài)平衡、避免使用藥物、確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全具有現(xiàn)實(shí)意義。本研究運(yùn)用16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)，研究RAS的水體與魚(yú)體中微生物種群結(jié)構(gòu)，確定循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的微生物群落特征，比較水體與魚(yú)體之間、不同魚(yú)種之間微生物群落結(jié)構(gòu)，揭示循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)部微生物群落的多樣性特征，為構(gòu)建健康養(yǎng)殖系統(tǒng)、進(jìn)一步提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.主要試劑

采用MagPure Soil DNA KF Kit試劑盒、 Qubit dsDNA Assay Kit、Tks Gflex DNA Polymerase、普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、Biowest Agarose(瓊脂糖)，引物由青島歐易生物科技有限公司合成。

2.樣品及預(yù)處理

牙鲆、石斑魚(yú)的成魚(yú)與水樣分別采集于山東省海陽(yáng)市某養(yǎng)殖公司的石斑魚(yú)與牙鲆RAS 養(yǎng)殖系統(tǒng)，用無(wú)菌采樣瓶采集養(yǎng)殖水體500毫升，樣品采集后低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，用0.22 微米濾膜抽濾后，將濾膜凍存于-80℃條件下。成魚(yú)停食24小時(shí)，置于無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行取樣，魚(yú)表皮組織黏液樣品通過(guò)無(wú)菌細(xì)胞刮刀輕輕地刮擦背外側(cè)收集；使用75%酒精棉擦拭魚(yú)體表面后用蒸餾水漂洗，對(duì)肌肉、腸道、肝臟、心臟、膽、胃等組織進(jìn)行無(wú)菌取樣，分為牙鲆組(組1)、石斑魚(yú)組(組2)，置于滅菌的EP 管中；每個(gè)樣品取兩個(gè)平行， 于-80℃保存，用于提取基因組DNA。

3.細(xì)菌基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

用試劑盒提取樣本的基因組DNA，檢測(cè)基因組DNA 含量和純度。采用引物343F(5'-TACGGRAGGCAGCAG-3')和798R(5'-AGGGTATCTAATCCT-3')擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 基因V3～V4 區(qū)。PCR 反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 分鐘；94℃變性30 秒，56℃退火30 秒，72℃延 伸20 秒，26 個(gè) 循 環(huán)；72℃延 伸5分鐘。

4.樣本的16S rDNA檢測(cè)和高通量測(cè)序

樣品的16S rDNA 高通量測(cè)序由青島歐易生物科技有限公司在Illumina-MiSeq 平臺(tái)上完成，使用Trimmomati 軟件對(duì)原始雙端序列去雜，采用Vsearch 軟件，將得到的有效序列按照97%的相似性進(jìn)行操作分類單元(OTUs)聚類。使用QIIME軟件包挑選出各個(gè)OTUs 的代表序列，并與Silva(version132)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì)，將所有代表序列進(jìn)行注釋。

5.生物信息學(xué)分析

對(duì)分類的OTUs 進(jìn)行物種注釋分析，得到相對(duì)應(yīng)的物種信息，根據(jù)物種注釋結(jié)果，在門(mén)、綱、目、科、屬5 個(gè)分類級(jí)別上生成物種相對(duì)豐度圖，根據(jù)分類學(xué)層次分析微生物的群落結(jié)構(gòu)以及物種豐度。應(yīng)用QIIME軟件進(jìn)行物種豐度分析，主要包括：①多樣性指數(shù)分析；②計(jì)算物種豐富度指數(shù)、覆蓋率等。分析各指數(shù)間的差異是反映微生物豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。

二、結(jié)果與分析

1.測(cè)序結(jié)果及取樣深度驗(yàn)證

提取兩組樣品DNA，測(cè)定質(zhì)量濃度與純度，用于分析循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)魚(yú)體與水體的細(xì)菌多樣性，采用目的條帶大小正確、濃度適合的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。兩組樣品共得到1 990 143 條有效序列，不同的組織樣本得到有效序列范圍為16 775～55 773條，各樣本操作分類單元個(gè)數(shù)分布在798～1 724 條。對(duì)樣品有效序列進(jìn)行OTUs 稀釋曲線分析，結(jié)果表明各樣品的曲線均隨序列數(shù)量的增加而趨于平緩，測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)的PCR擴(kuò)增序列能真實(shí)反映樣品細(xì)菌的群落組成。

2.微生物的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

對(duì)OTUs 的豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選擇兩組樣品中豐度最高的50個(gè)OTUs構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以熱圖形式分析OTUs 在不同樣品中的分布情況。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，50條reads共歸于5個(gè)門(mén)，兩組樣品的高豐度OTUs 一致，主要為擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、梭桿菌門(mén)。

3.微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)注釋結(jié)果，兩組樣品微生物群落結(jié)構(gòu)組成情況相似，共鑒定出30 個(gè)菌門(mén)、73 個(gè)綱、179個(gè)目、310個(gè)科、732個(gè)屬。但各種微生物所占比例略有差異，在門(mén)水平上，擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、ε-變形菌門(mén)、軟壁菌門(mén)、螺旋體門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)、迷蹤菌門(mén)、疣微菌門(mén)、藍(lán)光合菌門(mén)及Patescibacteria占細(xì)菌總量的98.12%以上。15 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的菌群結(jié)構(gòu)差異顯示，兩組樣品養(yǎng)殖水體以及各組織中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在門(mén)水平上差異不顯著，占比較高的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要為擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)與厚壁菌門(mén)，占細(xì)菌總量的85%以上，與黃志濤等(2016)報(bào)道的結(jié)果相似。

在綱的水平上，優(yōu)勢(shì)菌綱從高至低為擬桿菌綱、梭菌綱與變形菌綱，占比達(dá)87%以上；在目的水平上，擬桿菌目、梭菌目與腸桿菌目占比較其余13個(gè)目之和更高，約為75%；在科的水平上，前4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌科分別為擬桿菌科、腸桿菌科、疣微菌科與毛螺菌科；在屬的水平上，樣品中細(xì)菌豐度最高的分別為擬桿菌屬(Bacteroides)、大腸志賀氏桿菌屬(Escherichia-Shigella)、棲糞桿菌屬(Faecalibacterium)與其他菌屬。結(jié)果表明，兩組的養(yǎng)殖水體與魚(yú)體組織中細(xì)菌群落的構(gòu)成比較單一，在5個(gè)分類水平上都是少數(shù)類群占據(jù)絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)地位，其余大部分類群占很小的比例。

4.微生物多樣性分析

(1)樣品Alpha 多樣性分析。將所有樣本進(jìn)行聚類分析，根據(jù)序列之間的相似性將其劃分為不同的OTUs。結(jié)果顯示牙鲆與石斑魚(yú)樣品共有的OTUs為3 445個(gè)。

Alpha多樣性分析是指對(duì)樣品中微生物群落物種的多樣性進(jìn)行分析，主要包括分析微生物群落豐富度的ACE指數(shù)以及微生物群落均勻度與多樣性的辛普森指數(shù)及香農(nóng)指數(shù)(耿道強(qiáng)等，2020)。樣品多樣性情況見(jiàn)表1。由表1 可知，兩組樣品的群落多樣性和豐度上無(wú)顯著性差異，相對(duì)于牙鲆，石斑魚(yú)微生物群落多樣性和豐度水平更高。

表1 樣品多樣性情況

(2)樣品Beta多樣性分析。Beta多樣性為生物環(huán)境內(nèi)物種的多樣性程度，即比較不同分組樣本的差異。Beta多樣性分析主要包括PCA、PCoA分析等。每個(gè)點(diǎn)代表牙鲆與石斑魚(yú)養(yǎng)殖水體與各組織樣品，彼此之間的距離代表了它們的差異大小。如在Beta多樣性研究中，PCA分析運(yùn)用方差分解進(jìn)行，樣品組成越相似，則距離越近。結(jié)果顯示，兩種魚(yú)養(yǎng)殖水體與器官組織在PC1與PC2軸上差異并不明顯，兩組樣品的相似度較高，與Alpha多樣性分析結(jié)果相互印證。PCoA 是基于多種距離矩陣的分析結(jié)果，通過(guò)觀察物種個(gè)體或種群間的差異可直觀顯示不同樣品中微生物進(jìn)化上的相似性或差異性。結(jié)果顯示，同組的樣本距離較近，并與其他組有距離，兩組樣品之間在PC2軸上可以分離開(kāi)。菌群Beta 多樣性中各樣本的特征貢獻(xiàn)值分析發(fā)現(xiàn)，相較于牙鲆，石斑魚(yú)的菌群多樣性占比相對(duì)較高，為菌群多樣性的主要貢獻(xiàn)者。

三、討論

循環(huán)水養(yǎng)殖是一種現(xiàn)代化的高密度精養(yǎng)模式，目前廣泛應(yīng)用于鲆鰈類和石斑魚(yú)等市場(chǎng)價(jià)格較高的海水魚(yú)養(yǎng)殖。循環(huán)水養(yǎng)殖水體中微生物對(duì)魚(yú)的生長(zhǎng)、健康至關(guān)重要，微生物群落結(jié)構(gòu)的變化也是標(biāo)志養(yǎng)殖環(huán)境變化的一個(gè)重要方面(KLMARI S等，2019；SEKIROV I等，2010)。當(dāng)受到病原微生物感染時(shí)，菌群結(jié)構(gòu)失衡可能使得宿主的免疫系統(tǒng)受到影響，導(dǎo)致細(xì)菌性疾病暴發(fā)，因此，可以通過(guò)對(duì)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的監(jiān)測(cè)來(lái)研究該系統(tǒng)中微生物與宿主之間的相互關(guān)系，為水產(chǎn)品健康養(yǎng)殖、減少因違規(guī)用藥引發(fā)的水產(chǎn)業(yè)質(zhì)量安全問(wèn)題提供科學(xué)依據(jù)。本研究利用16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)牙鲆與石斑魚(yú)的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中水體細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，結(jié)果顯示二者的菌落結(jié)構(gòu)和多樣性基本一致，無(wú)明顯差異，這可能與他們的養(yǎng)殖水體、飼料、生活習(xí)性等因素相關(guān)。

梭桿菌綱是一類革蘭氏陰性細(xì)菌，部分具有一定的致病性。變形菌門(mén)是海洋環(huán)境和海洋沉積物中的主要菌門(mén)，其中的α-變形菌綱、β-變形菌綱可以降解水體中的多環(huán)芳烴(吳越等，2017)；γ-變形菌綱是目前已知細(xì)菌種類最多的綱(吳歡歡等，2019)，豐度與養(yǎng)殖水體營(yíng)養(yǎng)程度正相關(guān)，豐度越高，越有利于養(yǎng)殖動(dòng)物的健康生長(zhǎng)。大腸志賀氏桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，會(huì)引起魚(yú)體肛門(mén)及內(nèi)臟充血、出血，同時(shí)檢出的具有致病性的弧菌屬細(xì)菌，多數(shù)為條件致病菌或與魚(yú)病有關(guān)的病原菌，能夠引發(fā)魚(yú)的皮膚潰瘍、出血等癥狀(Zhang等，2020)；在養(yǎng)殖過(guò)程中，魚(yú)受到致病菌感染，易導(dǎo)致潛在弧菌病的暴發(fā)。因此，采取有效措施控制養(yǎng)殖環(huán)境中致病菌的數(shù)量對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物的健康至關(guān)重要。

相較于牙鲆，石斑魚(yú)組的香農(nóng)指數(shù)更高，這表明石斑魚(yú)組的16S rDNA 多樣性較高。聚類分析結(jié)果表明，牙鲆與石斑魚(yú)的水體菌群組成和群落結(jié)構(gòu)相似性較高。養(yǎng)殖模式相同的情況下， 樣品基本聚在一起，說(shuō)明在相同養(yǎng)殖模式下，菌群組成和群落結(jié)構(gòu)具有較高的相似性(吳歡歡等，2019)。

四、小結(jié)

本研究利用16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)牙鲆與石斑魚(yú)及其養(yǎng)殖水體的微生物多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，水體環(huán)境中的微生物參與魚(yú)體菌群的形成，并且在水體環(huán)境相似的情況下，不同品種的魚(yú)菌群結(jié)構(gòu)并無(wú)較大差異。因此，在RAS系統(tǒng)養(yǎng)殖過(guò)程中，可采取同樣管控方式，如加強(qiáng)養(yǎng)殖水體中微生物監(jiān)控來(lái)確保RAS系統(tǒng)中微生物的生態(tài)平衡，以實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖，杜絕水產(chǎn)品質(zhì)量安全事件的發(fā)生。