重組畢赤酵母表達棘孢木霉幾丁質酶gene02524的酶學性質及抑菌活性

尹義旭 湯偉 咸洪泉

摘要：幾丁質酶是催化降解幾丁質的水解酶，在防治植物真菌病害與蟲害方面的應用越來越廣泛，是一種重要的生防蛋白。棘孢木霉TD3104是一株優良的植物病害生防菌，幾丁質酶在抑菌防病過程中發揮重要作用。為克隆表達棘孢木霉TD3104幾丁質酶基因gene02514，明確酶學性質和抑菌活性，利用畢赤酵母表達系統對目的蛋白進行表達，并通過SephadexG-100凝膠進行純化，對序列進行分析并研究其酶學性質及進行體外抑菌試驗。本研究成功地構建了pPIC9K/gene02524重組載體，并且經過比對發現其包含GH18家族的特征氨基酸序列，獲得了畢赤酵母轉幾丁質酶基因工程菌，表達的重組幾丁質酶表觀分子量44.4 ku，K m=2.048 2 g/L，V max=0.635 5×103 μmol/（L·min），最適反應溫度為50 ℃，最適pH值為5.0，在pH值為3.5時穩定性最高;金屬離子Cu2+、Hg2+可強烈抑制酶活性;可抑制金黃殼囊孢菌等病原真菌的生長。研究結果為解析棘孢木霉幾丁質酶在生防中的作用及功能奠定了基礎，并為植物病蟲害的防治提供了新的基因資源。

關鍵詞：棘孢木霉;幾丁質酶;基因表達;畢赤酵母;酶學性質

中圖分類號：S188+.3 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）09-0096-07

植物真菌病害被認為是對作物產量影響最嚴重的因素[1]，會造成嚴重的經濟損失[2]。目前對植物真菌病害的防治普遍采用化學防治，這不僅會污染環境、破壞生態平衡，而且病原菌易產生抗藥性[3]，也可能會影響人的健康[4]。隨著人們環保意識以及個人保護意識的增強，生物防治由于其低成本、環境友好等特點逐漸成為防治病害時首先考慮的方法。

用于植物病害防治的生物因子主要包括細菌、真菌、放線菌，目前在生防真菌中木霉菌是應用比較廣泛的一類生防菌[5]。木霉菌對多種植物病害均有防治效果，并且對土壤生態平衡的影響最小，不會損害有助于控制病原體的有益生物體，可以提高植物抗病性，促進養分吸收和肥料利用，改善發育環境并提高產量[1]。幾丁質酶在木霉菌防治植物病害過程中發揮著重要作用。

幾丁質酶（chitinase，EC 3.3.2.14）是以幾丁質為底物，通過催化降解β-1-4-糖苷鍵將幾丁質（chitin）降解為N-乙酰氨基葡萄糖或寡聚N-乙酰氨基葡萄糖的水解酶[6-7]，在自然界中發揮著重要的作用。植物病原真菌的細胞壁主要由葡聚糖和幾丁質等物質組成[8]，生防木霉菌會產生幾丁質酶及葡聚糖酶等細胞壁降解酶[8-9]，對病原菌的細胞壁進行破壞，從而達到抑制病原真菌的效果，并且幾丁質酶在殺蟲劑的應用中也有良好的前景[10-11]。通過基因工程將幾丁質酶基因轉化到生防菌株或植物中，可以使生防菌生防效果增強或提高植物對病原菌的抗病性[12-13]。

棘孢木霉（Trichoderma asperellum）TD3104是一株優良的生防菌株，全基因組測序分析發現，該菌株有數十種幾丁質代謝相關的基因，其中有15個內切幾丁質酶基因。由于不同的幾丁質酶在生物中發揮著不同的作用，為了之后可以更好地了解幾丁質酶系統在木霉中所發揮的作用，尤其是在抑制病原菌方面的作用，本研究以內切幾丁質酶基因gene02524為研究對象，利用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統進行異源表達、分離純化，分析其酶學性質，檢測其對病原真菌生長的影響，為解析幾丁質酶系統中不同組分在生防中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

本試驗于2020—2021年在青島農業大學完成。

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

棘孢木霉TD3104、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、畢赤酵母GS115、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）、新月彎孢菌（Curvularia lunata）、金黃殼囊孢菌（Cytospora chrysosperma）、板栗疫病病原菌（Cryphonectria parasitica）均為筆者所在實驗室保存。

1.1.2 試劑

本試驗所需的Trizol、G418 antibiotic均購自Invitrogen 公司;EcoRⅠ與NotⅠ、StuⅠ均購自賽默飛世爾科技公司;pMD18-T vector、T 4連接酶、DNA Marker、RT-PCR試劑盒均購自TaKaRa公司;幾丁質、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。各類培養基參照Invitrogen 公司的畢赤酵母表達說明書配制。PCR引物合成與序列測序均由北京擎科生物科技有限公司完成，全基因組測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司于2020年2月完成。

1.2 目的序列的分析及重組載體的構建

Trizol法提總RNA之后反轉錄得到cDNA文庫，根據全基因組測序和注釋分析得到gene02524序列（圖1），根據序列設計擴增gene02524幾丁質酶CDS的特異性引物02524S：5′-CCGAATTCTCTGAGGGCGGTTATCGCT-3′;02524A：5′-GGGCGGCCGCTTAGTTATTTGGGAATCCATTCTT-3′。以cDNA文庫為模板，利用設計的特異性引物進行擴增，膠回收PCR產物，與T載體連接轉化DH5α感受態細胞，篩選測序得陽性克隆，提取質粒用EcoRⅠ和 NotⅠ? 酶切，將回收后的目的片段，與酶切后的酵母表達載體pPIC9K通過T 4 DNA連接酶，16 ℃過夜連接得到重組載體pPIC9K/gene02524，并進行雙酶切驗證。將正確的質粒通過StuⅠ線性化后轉入畢赤酵母GS115。酵母感受態的制備、轉化及篩選等操作參考Invitrogen 公司的酵母表達說明書進行。DNAMAN（https：//www.lynnon.com/dnaman.html）和WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）用來進行氨基酸的比對。

1.3 幾丁質酶的誘導表達及分離純化

幾丁質酶的誘導表達、分離純化及酶活力測定參照湯偉等對幾丁質酶Tachi1酶學性質研究的方法[14]。具體為：將重組表達gene02524工程株在 28 ℃、200 r/min條件下振蕩培養，每天加入甲醇誘導，維持甲醇終濃度為0.5%，并每天通過DNS法對酶活性進行檢測，3組重復。待酶活性穩定之后取菌液上清，將上清液使用硫酸銨沉淀獲得蛋白，透析除鹽后通過SephadexG-100凝膠純化。

1.4 幾丁質酶的酶學性質分析

1.4.1 幾丁質酶的最適溫度及溫度穩定性測定 分別在30～80 ℃溫度條件下測定表達的幾丁質酶gene02524的活性，將最高的酶活性定為100%，分別計算其余處理組的酶活性。并將純化后的酶液分別在35、40、45 ℃ 溫度下孵育一段時間（10、20、30、40、50、60 min），以最高的酶活性為100%，檢測酶活性。

1.4.2 最適pH值及pH值穩定性的測定 將表達的幾丁質酶液在不同pH值（3.0～10.0）條件下反應并測定其酶活性，將最高的酶活性定為100%，測定其余處理的酶活力。pH值穩定性則是將酶液置于最適溫度下于pH值為3.0～10.0體系中孵育 1 h，以最高的酶活性為100%，檢測其余處理的酶活性。不同的pH值由表1緩沖體系提供。

1.4.3 幾丁質酶gene02524米氏常數及酶促反應進程曲線的測定 酶促進程曲線為在最適環境中進行酶促反應，利用DNS法每隔10 min進行取樣并測定還原糖產量。將底物稀釋至終濃度分別為25、20、10、5、2.5 mg/mL，在最適條件下進行酶促反應，計算各處理的反應速度，做出Hans-Woolf曲線，得出米氏常數K m與V max。

1.4.4 測定反應體系中金屬離子對酶活性的影響 在酶反應體系中分別加入金屬離子（Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Hg2+、Zn2+、Ag+、K+、Na+、Mg2+、NH+ 4、Ba2+），使其終濃度為0.05 mol/L，測定不同處理組的幾丁質酶gene02524活性。將加水處理組的酶活性定義為100%，計算其余處理的相對酶活性。

1.4.5 變性劑和蛋白抑制劑對酶活性的影響 在最適條件下，分別在體系中配入供試的變性劑和蛋白抑制劑，使尿素終濃度分別為0.5、3.0 mol/L，十二烷基硫酸鈉（SDS）終濃度分別為0.1%、1.0%，乙二胺四乙酸（EDTA）與β-巰基乙醇終濃度為1、10 mmol/L，甘油、異丙醇、甲醇、乙醇的終濃度則分別設置1%和10% 2個濃度處理，將加入水的處理組的酶活性定義為100%，測定其余酶活。

1.5 幾丁質酶gene02524對病原真菌的抑制作用

將供試真菌接種于馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDA）板上，置于28 ℃培養箱中，待其長滿板后取菌塊于新的PDA平板中央，當菌落生長至3～4 cm時，在距菌落中心5 cm處放置4個無菌濾紙片，分別加入不同量（3、5、7 μg）的酶，繼續培養。以加滅菌水的處理為對照，參考下式計算抑菌率：

病原菌生長抑制率=（對照菌落半徑-處理菌落半徑）/對照菌落半徑×100%。

2 結果與分析

2.1 pPIC9K/gene02524重組質粒構建及序列分析

提取幾丁質誘導的棘孢木霉TD3104菌絲中的總RNA（圖2-a），以反轉錄得到的cDNA文庫為模板，02524S和02524A為引物，擴增得到gene02524基因編碼序列全長1 190 bp（圖2-b），經測序和序列比對，克隆的CDS序列正確。gene02524幾丁質酶基因含有2個內含子，大小分別為74、66 bp，編碼397個氨基酸，預測表達蛋白大小44.48 ku，理論等電點為5.67。將氨基酸序列與GH18家族的幾丁質酶比對，發現其包含GH18家族特征的序列SXGG及DXXDXDXE[15]（圖3-a、圖3-b）。構建的克隆載體和酵母重組表達載體分別命名為pMD-18T/gene02524和pPIC9K/gene02524，酶切鑒定結果與預期相符（圖2-c、圖2-d）。將pPIC9K/gene02524通過StuⅠ 線性化后轉入畢赤酵母GS115，經篩選得到表達重組幾丁質酶gene02524的酵母工程菌GS115/gene02524。

2.2 幾丁質酶的誘導表達及純化

誘導表達5 d之后酶活性趨于穩定（圖4-a），粗酶液經SephadexG-100凝膠過濾層析純化，經 SDS-PAGE 可以發現純化后的蛋白在44.4 ku大小處有一條帶（圖4-b），表觀分子量與預測大小一致。

2.3 幾丁質酶gene02524的酶學性質

2.3.1 最適溫度及溫度穩定性測定 在不同溫度下測定gene02524蛋白的酶活性，從圖5-a可以看出，該幾丁質酶的最適溫度為50 ℃，80 ℃時仍有活性，30～55 ℃范圍內具有50%以上活性，具有較寬的溫度適用性。將gene02524酶蛋白置于不同的溫度中孵育，并對其剩余酶活性進行檢測，可以看到該幾丁質酶在35 ℃以下活力基本沒有損失，保溫 60 min 后仍有超過80%的活力，在40 ℃與45 ℃下保溫 60 min 后仍然可剩30%左右的酶活力（圖5-b）。

2.3.2 最適pH值及pH值穩定性 研究發現gene02524蛋白不僅具有非常廣泛的pH值適用范圍（圖6-a），還擁有非常高的pH值穩定性（圖6-b）。

在pH值4.0～10.0范圍內均有較高的催化活性（剩余酶活>50%），最適pH值為5.0。在pH值為3.5時酶的穩定性最高，并且在pH值3.0～8.5范圍內孵育60 min后仍均保有80%以上的酶活力。

2.3.3 酶促反應進程曲線及米氏常數的測定 gene02524重組幾丁質酶的酶促反應在0～10 min內隨著反應的進行還原糖產量不斷增加，30 min后趨于穩定（圖7-a）。取反應時間0～10 min作酶動力學Hans-Woolf曲線（圖7-b），當膠體幾丁質為底物時，幾丁質酶gene02524的K m=2.048 2 g/L，V max=0.635 5×103 μmol/（L·min）。

2.3.4 金屬離子對gene02524酶活性的影響 供試金屬離子對gene02524酶活性有不同程度的抑制作用，研究發現Cu2+與Hg2+對酶活性抑制作用最強，剩余酶活性均只剩30%左右;而K+、Na+與NH+ 4則抑制酶活性較小，剩余酶活性均在70%以上;其他金屬離子相對酶活性在40%～60%之間（表2）。

2.3.5 變性劑和蛋白抑制劑對酶活性的影響 gene02524重組幾丁質酶對供試變性劑和蛋白抑制劑抵抗力較強，除SDS外其他試劑處理后酶活性均剩余50%以上;SDS對gene02524酶活性有明顯的抑制作用;1 mmol/L EDTA與10 mmol/L β-巰基乙醇對酶活性有一定的促進作用（表3）。

2.4 幾丁質酶gene02524對病原真菌的抑制作用

純化后的幾丁質酶gene02524對供試病原菌生長均有一定的抑制作用，并且存在一定的劑量效應。相同用量gene02524蛋白對金黃殼囊孢菌生長抑制作用最強，5 μg gene02524抑制率便能超過55%;3 μg gene02524對新月彎孢菌的抑菌率為15.56%，當酶量達到7 μg時，抑菌率增加到40.00%（表4）。

3 討論

微生物幾丁質酶的分子量一般在20～90 ku之間，胡仕鳳等統計了8種木霉的39個幾丁質酶，發現木霉幾丁質酶多為內切酶，并且大多數分子量為42 ku[16]。Lorito等研究發現，木霉幾丁質酶是對植物病原真菌非常有效的幾丁質酶，不僅能夠降解病原菌的菌絲，也對有幾丁質復合結構的細胞壁及菌核有降解作用[17-18]。畢赤酵母異源表達的gene02524與原核表達的幾丁質酶Tachi2相比，熱穩定性gene02524低于Tachi2;但是gene02524在pH值 3.0～8.5范圍內相對酶活性在80%以上，具有更高的pH值穩定性[19]。而gene02524與同為酵母異源表達的棘孢木霉幾丁質酶Tachi1相比，在熱穩定性上低于Tachi1，但是在pH值穩定性上高于Tachi1，并且當環境中存在金屬離子及變性劑和蛋白酶抑制劑時gene02524有更高的穩定性[14]，說明gene02524與已報道的棘孢木霉幾丁質酶相比具有一定的差異性。幾丁質酶對很多病原菌都有抑制效果，Olivera等研究發現不同的幾丁質酶作用方式不同[20]，所以不同的幾丁質酶對不同的病原菌抑制效果不同。本研究表達的gene02524與已報道的棘孢木霉幾丁質酶在酶學性質上有很多差異，這種酶性質的差異可能導致不同幾丁質酶在木霉中執行不同的生物學功能，有待于進一步深入研究。本研究實現了幾丁質酶gene02524的酵母表達，明確了gene02524的酶學性質和抑菌活性，為植物病害的防治提供了新的基因資源，同時也為進一步研究棘孢木霉中幾丁質酶的結構及功能奠定了基礎。

4 結論

本研究成功通過畢赤酵母表達系統表達了幾丁質酶gene02524，蛋白表觀分子量為44.4 ku，與理論分子量相符，gene02524基因編碼序列全長 1 190 bp，編碼397個氨基酸并包含GH18家族特征的序列SXGG及DXXDXDXE，理論等電點為5.67。最適反應溫度為50 ℃，在35 ℃下穩定性最好;gene02524蛋白具有非常廣泛的pH值適用范圍，在pH值4.0～10.0范圍內均有較高的催化活性（剩余酶活>50%），最適pH值為5.0，在pH值為3.5時穩定性最高;金屬離子對gene02524活性有明顯影響，其中Cu2+、Hg2+強烈抑制酶活性;SDS強烈抑制酶活性，1 mmol/L EDTA與10 mmol/L β- 巰基乙醇對酶活性有一定的促進作用。gene02524對供試的病原菌均有不同程度的抑制效果，抑菌譜較廣。

參考文獻：

[1]Sood M，Kapoor D，Kumar V，et al. Trichoderma：the “secrets” of a multitalented biocontrol agent[J]. Plants （Basel，Switzerland），2020，9（6）：762.

[2]Roberts M，Schimmelpfennig D，Ashley E，et al. The value of plant disease early-warning systems：a case study of USDAs soybean rust coordinated framework[J]. Economic Research Report，2006，26：1-48.

[3]Atreya K. Pesticide use in agriculture：the philosophy，complexities and opportunities[J]. Scientific Research and Essays，2012，7（25）：2168-2173

[4]Mwabulambo S G，Mrema E J，Ngowi A V，et al. Health symptoms associated with pesticides exposure among flower and onion pesticide applicators in arusha region[J]. Annals of Global Health，2018，84（3）：369-379.

[5]尤佳琪，吳明德，李國慶. 木霉在植物病害生物防治中的應用及作用機制[J]. 中國生物防治學報，2019，35（6）：966-976.

[6]湯 偉，夏 偉，李雅華，等. 棘孢木霉（Trichoderma asperellum）幾丁質酶基因的克隆與生物信息學分析[J]. 中國生物化學與分子生物學報，2012，28（4）：385-392.

[7]Yang J K，Zhang K Q. Chitin synthesis and degradation in fungi：biology and enzymes[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology，2019，1142：153-167.

[8]Elsherbiny E A，Amin B H，Aleem B，et al. Trichoderma volatile organic compounds as a biofumigation tool against late blight pathogen Phytophthora infestans in postharvest potato tubers[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2020，68（31）：8163-8171.

[9]de la Cruz J，Hidalgo-Gallego A，Lora J M，et al. Isolation and characterization of three chitinases from Trichoderma harzianum[J]. European Journal of Biochemistry，1992，206（3）：859-867.

[10]Chen W，Yang Q. Development of novel pesticides targeting insect chitinases：a minireview and perspective[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2020，68（16）：4559-4565.

[11]Mahmood S，Kumar M，Kumari P，et al. Novel insecticidal chitinase from the insect pathogen Xenorhabdus nematophila[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2020，159：394-401.

[12]Kumar V，Parkhi V，Kenerley C M，et al. Defense-related gene expression and enzyme activities in transgenic cotton plants expressing an endochitinase gene from Trichoderma virens in response to interaction with Rhizoctonia solani[J]. Planta，2009，230（2）：277-291.

[13]Shah M R，Mukherjee P K，Eapen S. Expression of a fungal endochitinase gene in transgenic tomato and tobacco results in enhanced tolerance to fungal pathogens[J]. Physiology and Molecular Biology of Plants，2010，16（1）：39-51.

[14]湯 偉，李雅華，劉 露，等. 重組畢赤酵母表達棘孢木霉幾丁質酶Tachi1的酶學性質研究及表達條件優化[J]. 微生物學報，2012，52（3）：345-352.

[15]Rosas-García N M，Fortuna-González J M，Barboza-Corona J E. Characterization of the chitinase gene in Bacillus thuringiensis Mexican isolates[J]. Folia Microbiologica，2013，58（6）：483-490.

[16]胡仕鳳，高必達，陳 捷. 木霉幾丁質酶及其基因的研究進展[J]. 中國生物防治，2008，24（4）：369-375.

[17]Lorito M，Peterbauer C，Hayes C K，et al. Synergistic interaction between fungal cell wall degrading enzymes and different antifungal compounds enhances inhibition of spore germination[J]. Microbiology，1994，140（Pt 3）：623-629.

[18]LoritoM，WooSL，DAmbrosiM，etal.Synergisticinteraction

between cell wall degrading enzymes and membrane affecting compounds[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，1996，9（3）：206-213.

[19]張軍霞，叢大鵬，李雅華，等. 棘孢木霉幾丁質酶tachi2基因的原核表達及酶學性質研究[J]. 中國生物工程雜志，2013，33（6）：45-51.

[20]Olivera I E，Fins K C，Rodriguez S A，et al. Glycoside hydrolases family 20 （GH20） represent putative virulence factors that are shared by animal pathogenic oomycetes，but are absent in phytopathogens[J]. BMC Microbiology，2016，16（1）：232.