西州密25 號哈密瓜葉片再生體系建立

劉麗鋒，古勤生，周建華

（1.中國農業科學院鄭州果樹研究所 鄭州 450009； 2.鄭州市蔬菜研究所 鄭州 450015）

西州密25 號是新疆維吾爾自治區葡萄瓜果研究中心廖新福研究員團隊于2007 年選育的哈密瓜類型甜瓜品種，由于富含多種維生素，色澤鮮艷，口感鮮甜，營養豐富，經濟價值高，因此深受消費者喜愛。但山高水遠，內地消費者很難吃到新鮮的哈密瓜，為打破地域限制，研究人員對哈密瓜“東移”“南移”開展研究，除新疆外，甘肅、陜西、安徽、內蒙古、山東、云南、廣東、廣西、海南等地區開始大面積引種種植。中國農業科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組于2011 年引種在河南省進行示范推廣種植，目前在河南省年均推廣面積高達67 hm，并呈逐年增加的趨勢。隨著生活水平的不斷提高，人們對果蔬品質的要求逐漸提升，為了滿足消費者對高品質哈密瓜的需求，通過人工輔助選擇篩選高品質的哈密瓜實現定向育種是目前遺傳育種的熱點。哈密瓜離體培養是哈密瓜品種改良、遺傳轉化的前提條件。其中，再生能力是關鍵因素，再生能力的差異除了基因型影響外，外植體類型不同導致的再生能力也不同。目前，甜瓜主要以子葉為外植體再生形成完整植株的途徑較多，但利用葉片作為外植體獲得再生植株途徑的文獻報道較少。不同類型外植體對甜瓜再生植株的倍性會產生影響，有研究表明甜瓜子葉誘導叢生芽的途徑容易發生倍性變化，而甜瓜經葉片途徑誘導會獲得大量二倍體植株，降低倍性干擾概率。西州密25 在河南省表現品質穩定，容易坐果，抗病性強，利用葉片誘導叢生芽獲得再生植株，避免倍性干擾，是實現轉基因甜瓜的主要條件。筆者以西州密25 號葉片作為外植體，設計不同的激素組合、暗培養時間等條件，對組培苗哈密瓜葉片和溫室栽培的哈密瓜葉片誘導叢生芽；設計不同激素濃度對伸長苗誘導生根，以期建立一套高效的哈密瓜葉片再生體系，為哈密瓜轉基因技術提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2019 年3 月至2020 年10 月在中國農業科學院鄭州果樹研究所果樹瓜類生物學重點實驗室、西瓜甜瓜病蟲害防控課題組玻璃溫室進行。

1.2 材料

供試材料為哈密瓜西州密25 號種子，由中國農業科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組提供。

1.3 方法

1.3.1 無菌苗培養 西州密25 號成熟種子剝去外殼后，70%酒精消毒30 s，0.1%氯化汞加2 滴Tween-20 殺菌10 min。無菌水沖洗5 次后，浸泡在無菌水中過夜，第2 天播種到1/2 MS+10 g·L蔗糖培養基上，置于組織培養室正常光周期培養條件下進行培養（光照16 h，黑暗8 h，溫度25℃，如無特別說明，無菌苗都在此環境中生長），待長出2～3 片真葉時，作為外植體使用。

1.3.2 溫室苗培養 西州密25 號成熟種子在水中浸泡3 h，然后用紗布包住，放入30 ℃恒溫培養箱，2～3 d 后胚根伸出，播入光照充足的玻璃溫室（晝28 ℃/夜20 ℃）的花盆中，待長出2～3 片真葉時，采回實驗室，在自來水下沖洗2 h，然后用70%酒精消毒30 s，0.1%氯化汞加2 滴Tween-20 殺菌5 min。無菌水沖洗5 次后作為外植體。

1.3.3 叢生芽誘導 將上述2 種處理的葉片作為外植體，切掉葉片四周邊緣，然后再將葉片切成5 mm×5 mm 的方塊接種到12 種叢生芽誘導培養基上（表1）誘導叢生芽；將無菌苗葉片接種到誘導培養基MS+2.0 mg·LBA+0.2 mg·LIAA，分別暗培養0、3、6、9、12、15 d，然后轉移到培養室光下培養，每處理3 次重復，每次重復9 個葉片，30 d 后觀察叢生芽生長情況并統計叢生芽誘導率。

表1 12 種誘導叢生芽分化的培養基組合

1.3.4 生根培養基 當不定芽伸長至2～3 cm 時，從基部切下轉接到以下8 種不同的生根培養基R1～R8，即1/2MS+（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0）mg·LIBA 誘導生根，每處理3 次重復，每次重復9 個伸長苗，30 d 觀察生根數、根長以及根系生長情況并統計。

愈傷組織誘導率/%=形成愈傷組織的葉片數/接種葉片數×100；

叢生芽誘導率/%=形成叢生芽的葉片數/接種葉片數×100。

1.4 數據分析

采用IBM SPSS Stastistic 22 軟件進行單因素方差分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同激素濃度對西州密25 號葉片誘導叢生芽的影響

由表2 可以看出，將2 種類型的葉片接種到不同濃度激素的12 種培養基上，葉片愈傷組織誘導率和叢生芽誘導率均有一定差異。在無菌條件下生長10 d 的無菌苗幼嫩葉片，在不同的培養基上均可以誘導愈傷組織，MS6、MS9、MS11 三種培養基誘導愈傷組織相對較高，分別達92.6%、96.3%、92.6%；叢生芽誘導率相對較高的是MS4、MS5、MS11 培養基，均為14.8%，MS2、MS6、MS7、MS10和MS12 等5 種培養基均未誘導出叢生芽；在這2種激素組合情況下，無菌苗葉片雖然能夠誘導叢生芽，但是誘導率很低。而溫室培養的葉片，愈傷組織誘導率在MS3、MS5、MS6、MS9、MS11 和MS12等6 種培養基中都可達100%，MS1 愈傷組織誘導率最低，為85.2%；不同的培養基均可以誘導叢生芽，MS11 培養基上誘導的叢生芽再生率高達85.2%，MS1 培養基誘導叢生芽效率最低，達25.9%，均高于無菌苗葉片誘導叢生芽的效率。結合無菌苗葉片和溫室葉片誘導叢生芽的情況，MS11相對其他培養基效果最好。

表2 激素濃度對甜瓜葉片誘導叢生芽的影響

2.2 暗培養對叢生芽誘導的影響

由表3 可以看出，葉片在正常光周期培養條件下，即暗培養0 d，將葉片直接切下接種到誘導培養基3～4 d 后，葉片膨大，15 d 左右切口處出現愈傷組織，30 d 時綠色愈傷組織誘導率達48.1%，此時叢生芽在綠色愈傷組織部位萌發，陸續出現芽點，叢生芽誘導率可達37.0%；暗培養12 d，30 d 時綠色愈傷組織誘導率可達37%，叢生芽誘導率達66.7%；暗培養15 d，30 d 時綠色愈傷組織誘導率為11%，叢生芽誘導率達48.2%。暗培養12 d 叢生芽誘導率達最高，為66.7%。其他時間叢生芽誘導率沒有顯著差異。光照對西州密25 號葉片產生愈傷組織和叢生芽的誘導影響較大。經過0～15 d 不同時間的暗培養，葉片均可以誘導愈傷組織，愈傷組織誘導率為100%。經過暗培養的葉片，從暗處剛轉移到正常光周期培養條件下，葉片為淺黃色、愈傷組織均為白色，經過1～2 d，葉片很快轉為綠色，愈傷組織呈現白色、淺黃色，30 d 后愈傷組織有的仍然呈現白色疏松狀，這種類型的愈傷組織只會膨大，不能誘導出叢生芽（圖1 白色箭頭指示）；有的呈現綠色緊致狀，逐漸分化出綠色芽點，誘導形成叢生芽（圖1 紅色箭頭指示，圖2 顯微鏡下綠色致密愈傷組織誘導生成叢生芽狀態）。

表3 暗培養對甜瓜葉片誘導叢生芽的影響

圖1 兩種類型愈傷組織及叢生芽

圖2 顯微鏡下綠色愈傷組織誘導叢生芽

2.3 不同IBA濃度對生根的影響

西州密25 號葉片誘導獲得的叢生芽在MS+0.5 mg·LBA 培養基繼代培養，當不定芽伸長到2 cm 時，切下轉移到8 種生根培養基，7 d 后出現不定根，15 d 左右長成完整植株。由表4 可以看出，8種生根培養基均可以誘導不定芽生根，說明西州密25 生根容易，IBA 質量濃度為0.5～4.0 mg·L均可以誘導生根，在R2、R3、R6、R7、R8 等5 種培養基中生根率均可達到100%，在R1 培養基中生根率較低，也可以達到71.4%。結合根的數量和主根長度，R2 生根培養基優于其他培養基。

表4 不同IBA 濃度對生根的影響

3 討論與結論

外植體的選擇對于組織培養再生體系的建立至關重要，甜瓜子葉誘導叢生芽效率最高，是首選的外植體。葉片可以通過繼代培養組培苗以及大田、溫室種植的植株被源源不斷地提供，再生不容易產生倍性變化，尤其對于稀有甜瓜品種，利用葉片作為外植體意義重大。王福蘭等利用甘甜一號無菌苗葉片誘導不定芽，再生率達到91%；馮鳳娟等利用西甜一號繼代3 周的2～3 片新梢葉片誘導不定芽，再生率最高可達91%；GUIS 等采用生長10 d 的法國當地品種無菌苗葉片誘導不定芽，再生率達72%；Kintzios 等利用溫室生長的Galia 第1片真葉誘導不定芽，再生率達60%。Yadav 等利用Hale’s Best Jumbo 組培苗葉片和溫室生長的葉片誘導不定芽，再生率分別為8%和80%以上。

筆者采用組培苗葉片和溫室生長的甜瓜葉片誘導不定芽，繼代生長10 d 的無菌組培苗幼嫩葉片，在培養基MS+2.0 mg·LBA+0.2 mg·LIAA 中誘導叢生芽效率相對較高，達14.8%；溫室培養的植株葉片在MS+2.0 mg·LBA+0.2 mg·LIAA 培養基中的叢生芽誘導率高達85.2%。結果與Yadav等的試驗結果相似，溫室生長的葉片再生率遠高于無菌苗誘導叢生芽的再生率，原因可能與光照、溫度等外在培養環境條件，以及甜瓜植株生長形態、基因型、葉片年齡等都有關系，繼代培養的甜瓜葉片生理和生化都產生了變化，器官發生能力下降，再生率也會降低。

暗培養對很多植物再生是必需條件。已有研究表明，黑暗條件可以減少植物酚類物質的溢出，有利于不定芽的分化。也有研究指出，黑暗條件會導致植物體內生長素增多，促進愈傷組織的形成，不利于不定芽的分化。馮鳳娟等試驗結果表明，直接轉入正常光周期比經過暗培養有利于不定芽的再生。本試驗結果表明，暗培養一定時間有助于甜瓜葉片誘導叢生芽，暗培養12 d，叢生芽的誘導率最高，可以達到66.7%。結論不同的主要原因可能是基因型、外植體類型、激素種類及濃度等不同。暗培養的作用機制復雜，其對外植體再生芽的誘導機制需進一步研究。

甜瓜生根相對容易，添加不同濃度的IAA、IBA誘導甜瓜生根率達70%以上。本試驗結果表明，1/2 MS 培養基中添加0.5～4.0 mg·LIBA 均可誘導生根，在培養基1/2 MS+1.0 mg·LIBA 中，生根效果最好，平均根數達到7.7，主根長達到9.6 cm，生根率達到100%。

甜瓜基因型不同、外植體來源不同、激素條件不同，均會導致試驗結果不完全一致，但是可以利用葉片誘導獲得叢生芽，本試驗為以后科研工作者利用甜瓜葉片誘導叢生芽提供了參考依據。