內生拮抗細菌264ZY7 的生物學特性測定及發酵條件優化

劉 華，馮中紅，李統華，楊成德

（1.甘肅省經濟作物技術推廣站 蘭州 730000； 2.甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室·甘肅農業大學植物保護學院 蘭州 730070）

隨著我國經濟發展和人們生活水平的提高，對農業發展的追求已從單純的高產轉化為優質安全。化學農藥的過量使用甚至濫用，造成了農藥污染、農藥殘留、土壤多樣性破壞和食品安全性降低等問題。于是生物防治成為近年來新的研究熱點。生物防治具有高效無污染、無毒無公害等基本特點，不但與綠色食品的需求相符合，還可保障農業可持續發展。具有顯著生防作用的內生細菌在大面積推廣應用到田間前需制成生防菌劑，且該生防菌劑須具備生防物質活性高和存儲時間長等特點，而發酵工藝的優化可提高拮抗菌株的生物量和活性，并降低生產成本。解淀粉芽孢桿菌中許多菌株能分泌抗菌物質、產生拮抗作用、營養與空間的競爭及誘導寄主產生抗性和促進植物生長等，是具有開發生物農藥潛力的微生物。本試驗中，解淀粉芽孢桿菌264ZY7 是一株從高寒草甸牧草中分離得到的內生細菌，對馬鈴薯炭疽病菌（）、馬鈴薯枯萎病菌（）、小麥根腐病菌（）、黃瓜枯萎病菌（.）、番茄灰霉病菌（）和馬鈴薯褐腐病菌（）等真菌和番茄細菌性斑點病菌（pv.）等細菌均有良好的拮抗作用。因此，2016 年在甘肅農業大學植物病原細菌及細菌多樣性實驗室對解淀粉芽孢桿菌264ZY7 的生長及促生特性進行測定，并結合單因素試驗和正交設計試驗對其高密度發酵培養條件進行優化，以期為菌株264ZY7 規模化生產、開發新型生防制劑奠定基礎，并為進一步田間的小試和中試提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

解淀粉芽孢桿菌（）264ZY7 由甘肅農業大學植物保護學院植物病原細菌及細菌多樣性實驗室保存。

1.2 供試培養基

牛肉膏蛋白胨培養基NA 和培養液NB，PKO平板培養基和孟金娜平板培養基，阿須貝培養基。

1.3 生長及促生特性測定

1.3.1 生長溫度測定 最低溫度測定：將待測菌株于NA 斜面培養基上進行劃線，分別置于溫度梯度為0、2、4、6、8、10、12、14、16 ℃的恒溫培養箱中培養24 h，觀察其生長情況；3 次重復（每個重復樣本數5 個，下同）。

最高溫度測定：將待測菌株于NA 斜面培養基上進行劃線，分別置于溫度梯度為45、47、49、51、53、55、57、59、61 ℃的恒溫培養箱中，培養24 h 后觀察其生長情況；3 次重復。

致死溫度測定：將待測菌株培養液接于裝10 mL NB 培養液的試管中，分別經90、91、92、93、94、95、100、105、110 ℃的高溫處理10 min 后，取0.1 mL 菌懸液均勻涂布于NA 平板上，并于28 ℃培養箱中培養，48 h 后觀察并記錄菌落生長情況；3次重復。

最適溫度測定：取0.03 mL 待測菌株培養液接于裝3 mL NB 培養液的試管中，以接無菌水培養液為對照，分別置于22、24、26、28、32、34、36 ℃的搖床培養（轉速180 r·min），3 次重復，24 h 后測定OD值。

1.3.2 最適生長pH 測定 將NB 培養液初始pH用40%NaOH 和40%HCl 分別調為3、4、5、6、7、8、9、10 和11，取0.03 mL 待測菌株接于裝有3 mL NB培養液的試管中，以無菌水培養液為對照，于28 ℃、180 r·min搖床中培養，3 次重復，12 h 后測定OD值。

1.3.3 生長曲線測定 取0.03 mL 待測菌株接于裝有3 mL NB 培養液的試管中，以接無菌水培養液為對照，于28 ℃、180 r·min搖床中培養，3 次重復，前3 h 每隔30 min 檢測一次OD值，3 h 后每隔1 h測一次。以OD值為縱坐標，以培養時間為橫坐標，制作生長曲線。

1.3.4 生物學功能的研究 溶磷能力采用溶磷圈法，即將待測菌株分別點接在PKO 和孟金娜平板培養基上，同時，用無菌水點接作為對照，28 ℃培養3～5 d，菌落周圍出現透亮溶磷圈的記錄為陽性，否則為陰性；將待測菌株用劃線法接于阿須貝培養基上，3 次重復，以接無菌水為對照，28 ℃培養，在第3天和第7 天檢查其生長情況，在培養基上明顯生長者記為陽性，繼代培養3 代仍為陽性，則認為具有固氮能力；利用Salkowski 法測定產IAA 能力。

1.4 發酵條件優化

1.4.1 種子液制備 將已活化的新鮮待測菌株接于NA 培養液（100 mL·150 mL三角瓶）中，振蕩培養（180 r·min，28 ℃）24 h，制得種子液。

1.4.2 碳、氮源及無機鹽篩選 供試碳源：A 蔗糖；B 玉米淀粉；C 水溶性淀粉；D 麥芽糖；E 乳糖；F 不加糖；CK NB 培養基。將以上碳源分別替換基礎培養液（40 mL·150 mL三角瓶）中葡萄糖，接入種子液2 mL，振蕩培養（180 r·min，28 ℃）24 h，3 次重復，測定發酵液OD值，以OD值確定最佳碳源。

供試氮源：A 尿素；B（NH）SO；C KNO；D NHCl；E 酵母膏；F 不加氮；CK NB 培養液。將以上氮源分別替換基礎培養基中蛋白胨，其他處理同碳源篩選，以確定最佳氮源。

無機鹽：A MgSO；B KHPO；C MnSO；D Cu-SO；E CaCl；F 不加無機鹽離子；CK NB 培養基。將以上無機鹽分別替換基礎培養基中NaCl，其他處理同碳源篩選，以確定無機鹽。

1.4.3 正交試驗設計 根據單因素試驗篩選結果，將最適碳、氮源和無機鹽按不同濃度進行L9（3）正交試驗（表1），28 ℃，180 r·min搖床振蕩培養24 h，通過檢測發酵液OD值，分析方差顯著性，確定最優培養基組合。

表1 L9（33）正交試驗設計

1.4.4 搖瓶發酵條件優化 設定pH 為5、6、7、8、9，溫度為20、24、28、32、36 ℃，搖床轉速為150、180、210、240、270 r·min，接種量為0.5%、1%、2%、6%、10%，裝液量為150 mL 三角瓶中分裝20、40、60、80 和100 mL 培養液，3 次重復；在最佳培養基上分別振蕩培養24 h，檢測發酵液OD，篩選發酵條件。

1.4.5 100 L 發酵罐放罐時間確定 在最佳發酵培養基和培養條件下，對生防菌株進行連續培養，每隔3 h 取樣，3 次重復，測定發酵液OD值，確定100 L 發酵罐中最佳放罐時間。

1.5 數據處理

利用Excel 2010 和SPSS 19.0 等軟件進行試驗設計與數據處理。

2 結果與分析

2.1 生長及促生測定

2.1.1 最低、最高、致死和最適生長溫度的測定由圖1 可知，菌株264ZY7 在溫度低于2 ℃或高于55 ℃時不生長，在30～36 ℃時OD明顯高于其他溫度，在110 ℃水浴10 min 后涂于NA 平板上48 h后未發現菌落，表明菌株264ZY7 最高生長溫度為55 ℃，最低、致死和最適溫度分別為2 ℃、110 ℃和30～36 ℃。

圖1 最適生長溫度測定

2.1.2 生長pH 值測定 由圖2 可知，pH 值在4 及以下時菌株264ZY7 生長明顯受限，pH 值在5～7范圍時生長良好，其OD高于其他pH 值，pH 超過8 時，菌株生長減緩，pH 值達到11 時菌株不生長。這表明菌株264ZY7 最適生長pH 值為5～7，低于4和高于8 不利于其生長。

圖2 菌株264ZY7 最適生長pH

2.1.3 生長曲線測定 由圖3 可知，菌株264ZY7在0～5 h 為遲緩期，在5 h 后進入對數生長期，14 h后進入穩定期，在30 h 時菌株生物量上升到最大值，之后進入衰退期（圖3）。

圖3 菌株264ZY7 生長曲線

2.1.4 促生能力表征測定 菌株264ZY7 在無氮阿須貝培養基上培養7 d 可以正常生長，且連續培養3 代均可形成明顯菌落，說明菌株具有穩定的固氮能力；在溶磷培養基上不形成透明圈，說明無溶磷作用；在含色氨酸和不含色氨酸的培養液中分別加入比色液均表現為淡紅色或血紅色的陽性反應（圖4），表明菌株有產IAA 的能力。

圖4 產IAA 能力的定性測定

2.2 碳、氮源及無機鹽篩選

2.2.1 碳、氮源及無機鹽篩選 由圖5 可以看出，菌株264ZY7 碳源為蔗糖時，OD顯著大于其他碳源，即最適碳源為蔗糖。

圖5 碳源對菌株264ZY7 生長的影響

由圖6 可以看出，在酵母膏為氮源的培養基上OD顯著高于其他氮源，說明酵母膏是最適氮源，尿素對該菌株有顯著的抑制作用。

圖6 氮源對菌株264ZY7 生長的影響

由圖7 可以看出，CK（無機鹽為NaCl）時發酵液OD顯著高于其他無機鹽，表明NaCl 是最佳無機鹽，CuSO與MnSO對其有顯著的抑制作用。

圖7 無機鹽對生防菌株264ZY7 生長的影響

2.2.2 碳、氮源及無機鹽濃度優化 菌株264ZY7在碳源濃度（，后同）為蔗糖20 g·L時，OD顯著大于其他碳源濃度，即最佳碳源濃度為蔗糖20 g·L；氮源酵母膏濃度為4 g·L時，OD顯著大于其他氮源酵母膏濃度，即最佳氮源濃度為酵母膏4 g·L；無機鹽濃度為NaCl 5 g·L時，OD顯著大于其他NaCl 濃度，即最佳無機鹽濃度為NaCl 5 g·L（圖8、圖9、圖10）。

圖8 碳源濃度對菌株264ZY7 生長的影響

圖9 氮源濃度對菌株264ZY7 生長的影響

圖10 無機鹽離子濃度對菌株264ZY7 生長的影響

2.3 正交試驗

由表2 正交試驗可知，菌株264ZY7 在蔗糖25 g、NaCl 5 g、酵母膏5 g、水1000 mL 的培養液中OD顯著大于其他正交試驗，表明最適宜菌株264ZY7 生長為牛肉膏3 g、蔗糖25 g、NaCl 5 g、酵母膏5 g、水1000 mL。

表2 正交試驗優化結果

2.4 搖瓶發酵條件的優化

2.4.1 最適pH 值篩選 由圖11 可知，菌株264ZY7 在pH 6 時生長最快，且顯著大于其他pH值下的OD，表明菌株264ZY7 生長的最適pH 值為6。

圖11 pH 對菌株264ZY7 生長的影響

2.4.2 最適溫度篩選 由圖12 可知，菌株264ZY7在溫度為28 ℃時OD最大，且顯著大于其他溫度下OD值，表明適宜菌株264ZY7 生長的最適溫度為28 ℃。

圖12 溫度對菌株264ZY7 生長的影響

2.4.3 最佳接種量篩選 由圖13 可知，菌株264ZY7 接種量為1%時OD最大，且顯著高于其他接種量條件下的OD，表明該菌株生長最適的接種量為1%。

圖13 接種量對菌株264ZY7 生長的影響

2.4.4 最佳裝液量篩選 由圖14 可知，菌株264ZY7 的裝液量為40 mL·150 mL時OD顯著高于其他裝液量條件，即最佳裝液量為40 mL·150 mL。

圖14 裝液量對菌株264ZY7 生長的影響

2.4.5 最佳轉速篩選 由圖15 可知，菌株264ZY7在搖床轉速為240 r·min時OD達到最大，且顯著高于其他轉速時的生物量，表明該菌株生長最適的搖床轉速為240 r·min。

圖15 搖床轉速對菌株264ZY7 生長的影響

2.4.6 100 L 發酵罐放罐時間確定 由圖16 可知，在最佳搖瓶發酵條件下對菌株264ZY7 進行100 L發酵罐擴大培養，菌株264ZY7 在21 h 時OD極顯著高于其他時間，表明菌株264ZY7 的發酵罐最佳放罐時間為21 h。

圖16 發酵時間對菌株264ZY7 生長的影響

3 討論與結論

高寒草甸內生細菌因其特殊的生境條件及抗逆性強等特點，是開發生防制劑的首選。王玉琴等從東祁連山高寒牧草中分離出內生細菌265ZY4 可有效抑制多種病原菌的生長，并且有固氮、溶磷和分泌IAA 等多種生物學功能。郭海等報道了高寒草地矮生嵩草內生細菌262AG6 對馬鈴薯炭疽病的抑制效果達到81.33%。筆者試驗測定了菌株264ZY7 的固氮、溶磷、產IAA 能力及最低、最高、致死、最適生長溫度、pH 和生長曲線。結果表明，菌株264ZY7 具有穩定的固氮和產IAA 能力，最高生長溫度55 ℃、最低生長溫度2 ℃、致死溫度110 ℃、最適溫度30～36 ℃，最適pH 值5～7。致死溫度110 ℃，比楊冬靜等報道的解淀粉芽孢桿菌的致死溫度（100 ℃）高，表明菌株264ZY7 更耐受加工制備成生防制劑過程中的高溫等條件；與張娟等報道的解淀粉芽孢桿菌pH 為中性的結論基本一致。生長曲線表明，在5 h 進入對數生長期，在10～14 h 時進入穩定生長期，與王卉等報道的解淀粉芽孢桿菌L-S60 在10 h 進入對數生長期、在20 h 時進入穩定生長期的結果相比培養時間極度縮短，表明菌株264ZY7 能在較短的時間內培養出高密度的生物量，在病害防治中所需時間縮短，能方便快捷的運用于生產中。

對生防內生細菌發酵條件優化有利于菌株的培養和用于生產中。馮中紅等對抗馬鈴薯壞疽病的莫海威芽孢桿菌ZA1 培養條件的優化得到最佳培養基配比氯化銨14.25 g、玉米粉19 g、馬鈴薯237 g、水1000 mL，最佳發酵條件pH 7.7、培養溫度28 ℃、轉速180 r·min及發酵時間36 h，ZA1 優化后活菌數為4.12×10CFU·mL。本試驗中菌株264ZY7 對多種病原真菌和番茄丁香假單胞葉斑病菌都有較強的抑制效果，為了使其較快的進入工業化生產并應用到田間地頭，試驗通過單因素和正交設計試驗優化了其發酵工藝。結果表明，菌株264ZY7 的最優培養基配比及生長條件為：牛肉膏3 g，蔗糖25 g，NaCl 5 g，酵母膏5 g，水1000 mL；溫度為28 ℃；接種量為1%；裝液量為40 mL·150 mL；搖床轉速為240 r·min；pH 6；100 L 發酵罐放罐時間為21 h。與劉京蘭報道的內生解淀粉芽孢桿菌優化后的發酵條件為pH 6，發酵溫度28 ℃等的結論接近，最佳接菌量比7%少。與李鑫等報道的解淀粉芽孢桿菌HRH-317 優化后的發酵條件pH 7，最佳接菌量3.8%、最佳時間21 h，最適溫度37 ℃相比，最佳接種量少，最適溫度低于李鑫等報道的解淀粉芽孢桿菌HRH-317 的最適溫度且更近于常溫，比梁艷瓊等和洪鵬等報道的解淀粉芽孢桿菌的最佳接種時間48 h 短，表明本試驗中的生防菌能在較低要求的培養條件下獲得較多的有益產物，且此差異的出現也可能由菌株的來源不同所致。經過發酵工藝的優化，菌株264ZY7 的生物量顯著高于優化前（發酵前最高的OD1.69，發酵后的OD10.37），該結論為菌株264ZY7 進入工業化生產奠定了良好的基礎。但菌株264ZY7 的抑菌物質及在番茄根、莖、葉內的定殖動態尚不明確，此還有待于進一步研究探討。

內生拮抗細菌264ZY7 具有穩定的固氮和產IAA 能力，在牛肉膏3 g、蔗糖25 g、NaCl 5 g 和酵母膏5 g，水補足至1000 mL 和pH 6 的培養基中，于28 ℃、接種量1%、裝液量40 mL·150 mL和轉速240 r·min條件下發酵21 h 的OD達10.37。該研究結果為利用內生拮抗細菌264ZY7 開發生防制劑奠定了基礎。