5種光周期對(duì)錦鯉生長、能量收支及生物鐘基因表達(dá)的影響

史東杰 王文峰 李文通 魏 東 王賽賽 姜巨峰

(1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院, 水產(chǎn)科學(xué)研究所, 北京 100068; 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 10097;3. 北京市房山區(qū)養(yǎng)殖業(yè)技術(shù)推廣站, 北京 102488; 4. 天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院, 天津 300380;5. 天津市水產(chǎn)研究所暨天津市觀賞魚技術(shù)工程中心, 天津 300221)

光照、溫度和食物等對(duì)硬骨魚類胚胎發(fā)育、生長、繁殖和性別分化等具有重要影響[1,2]。光照主要包括光周期、光譜和光強(qiáng), 在自然界所有物理影響因素中, 光周期最為規(guī)律, 是唯一能夠?yàn)閯?dòng)物提供季節(jié)性穩(wěn)定節(jié)律的環(huán)境因子。不同魚類具有不同的生理節(jié)律、運(yùn)動(dòng)行為、基因表達(dá)及生理生化功能, 這些生命活動(dòng)與光周期同步[3—5]。

研究發(fā)現(xiàn), 光信號(hào)傳輸至機(jī)體松果體控制生物鐘基因震蕩、激素水平漲落、識(shí)別功能及記憶力等生命活動(dòng)。魏萍萍等[6]研究表明, 在光周期8L∶16D處理組, 紅鰭東方鲀腦組織中的生長激素GH基因和生長激素抑制素SS基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于光周期24L∶0D處理組, 且兩種基因的表達(dá)水平在光周期8L∶16D和12L∶12D實(shí)驗(yàn)條件下表現(xiàn)出夜高晝低的特點(diǎn)。劉春曉等[7]實(shí)驗(yàn)證明, 連續(xù)光照可有效提高斑馬魚(Danio rerio)卵巢轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族/Samd (TGF-β/Smad) 信號(hào)通路基因的相對(duì)表達(dá)量。袁滿等[8]研究發(fā)現(xiàn), 在光周期12L∶12D條件下, 花鱸(Lateolabrax maculatus)垂體中生物鐘基因Cry1/2、Per2、Cry1a和Timeless呈現(xiàn)晝夜節(jié)律。Brown等[9]研究認(rèn)為, 長光照15L∶9D能使加利福尼亞銀魚(Leuresthestenuis)性腺偏雌發(fā)育, 光照12L∶12D則使性腺偏雄發(fā)育。Shin等[10]的研究表明, 在長光照14L∶10D條件下, 金魚(Carassius auratus)的GnRHs、GYHs、Kiss1/GPR54 mRNA及血漿促卵泡生成素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、17α-羥基孕烯醇酮(17α-hydroxypregnenolone)水平明顯高于短光照10L∶14D和對(duì)照組12L∶12D。這些研究表明, 光周期對(duì)魚類生長、能量收支和基因表達(dá)具有調(diào)控作用。

錦鯉(Cyprinus carpio)隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鯉屬(Cyprinus), 其體型健美, 色彩艷麗, 斑紋變幻莫測(cè), 是歐亞地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)型觀賞魚養(yǎng)殖品種。目前, 有關(guān)光周期對(duì)錦鯉生長影響的報(bào)道甚少, 本研究擬開展5種光周期對(duì)錦鯉生長、能量收支及生物鐘基因表達(dá)影響的研究, 為錦鯉養(yǎng)殖業(yè)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚及養(yǎng)殖條件

實(shí)驗(yàn)魚來自北京市觀賞魚創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)大興綜合實(shí)驗(yàn)站自家產(chǎn)群體, 日光溫室條件下養(yǎng)殖, 14d后隨機(jī)挑選體質(zhì)健壯、規(guī)格相近的錦鯉750尾(126.37±5.62) g, 于實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水系統(tǒng)進(jìn)行玻璃缸養(yǎng)殖, 每個(gè)養(yǎng)殖用玻璃缸(2.0 m×0.8 m×0.6 m)50尾, 15個(gè)缸。養(yǎng)殖水溫(21±1)℃, 溶解氧≥4 mg/L, 每天上午9:00—9:30、下午15:00—15:30各投喂1次, 投喂正規(guī)廠家生產(chǎn)的商品膨化飼料, 日投喂量為魚體重的2%—3%, 并根據(jù)攝食情況做適當(dāng)調(diào)整。每5—7d換水1次, 每次換水量為總水量的15%, 24h充氣。實(shí)驗(yàn)室24h開啟20W節(jié)能燈補(bǔ)充光照, 選用黑色遮光布避光。使用測(cè)量?jī)x測(cè)量光強(qiáng), 在整個(gè)養(yǎng)殖過程中,水面處的光強(qiáng)為750 lx。暫養(yǎng)期和正式實(shí)驗(yàn)期, 除光周期處理不同外, 其他條件不變。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

實(shí)驗(yàn)魚在養(yǎng)殖缸暫養(yǎng)7d后, 開始正式。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)5個(gè)光周期: 長光照18L∶6D (光照時(shí)間8:00—次日2:00)、短光照8L∶16D (光照時(shí)間8:00—16:00)、連續(xù)光照24L∶0D (光照時(shí)間8:00—次日8:00)、連續(xù)黑暗0L∶24D (無光照)和對(duì)照組12L∶12D (光照時(shí)間8:00—20:00)。光源采用LED光源(深圳市綠源燈光設(shè)備有限公司), 光色為白色(λ400—780 nm)。1個(gè)玻璃缸對(duì)應(yīng)一個(gè)光周期處理組, 每組設(shè)3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)周期為90d。實(shí)驗(yàn)第1天, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取30尾實(shí)驗(yàn)魚測(cè)量體質(zhì)量、干重和魚體干物質(zhì)能值。實(shí)驗(yàn)第15、第30、第45、第60、第75和第90天進(jìn)行采樣, 每次隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)魚30尾, MS-222(0.1g/L)麻醉, 測(cè)量體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)第90天, 每個(gè)光周期處理組隨機(jī)取60尾實(shí)驗(yàn)魚在冰盤上解剖取全腦組織, 迅速至液氮速凍后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆? 并隨機(jī)取30尾實(shí)驗(yàn)魚測(cè)量干重、魚體干物質(zhì)能值和含氮量。實(shí)驗(yàn)期間記錄成活率、飼料量、糞便量和殘餌量等數(shù)據(jù), 每次在投喂1h后及投喂前用虹吸法移出糞便和殘餌, 于70℃烘干、研磨、稱重, 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA提取與生物鐘基因表達(dá)量測(cè)定

TRIzol法提取不同光周期條件下實(shí)驗(yàn)魚全腦的總RNA, 用瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性, 要求A260nm/A280nm的值為1.8—2.0[11], 瓊脂糖凝膠濃度為1.5%。根據(jù)SYBR Premix ExTaqTMⅡKit (Tli RNaseH Plus)的引物設(shè)計(jì)原則, 用Premier 5軟件設(shè)計(jì)生物鐘基因Clock、Cry1、Bmal1、Per2基因和βactin基因的特異引物。β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因。引物委托寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列信息見表 1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物信息Tab. 1 Primers used in the study

參照TransScript?Oen-Step gDNA Removal and cDNA Super Mix 說明書要求將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 使用LightCycle96儀器和SG Fast qPCR Master Mix(2×)試劑盒進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系:共20 μL, 2×SYBR Premix FxTaqⅡ10 μL, 上游、下游引物(10 μmol/L) 分別為0.6 μL, cDNA模板1.0 μL,50×Passive Reference Dye Ⅱ0.4 μL, 蒸餾水8 μL。反應(yīng)條件: 95℃變性8s, 60℃退火20s, 95℃延伸15s,重復(fù)45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均重復(fù)3次。

1.4 指標(biāo)分析與數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用mean±SD表示。用SPSS19.0 軟件進(jìn)行單因子方差和多重比較, 分析不同光周期處理?xiàng)l件下錦鯉生長指標(biāo)、能量收支和生物鐘基因Clock、Cry1、Bmal1和Per2相對(duì)表達(dá)量等各數(shù)據(jù)差異的顯著性, 顯著水平為0.05。RT-PCR相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt計(jì)算[12]。

特定生長率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)、成活率(SR)計(jì)算方法如下:SGR(%/d)=(lnW1- lnW0)/d×100;FCR=T/(W1＋W2-W0);SR(%)=S1/S0×100。式中,W0、W1和W2分別為魚初始體重(濕重)、終末體重(濕重)和死魚重量(濕重);T為總投喂量;d為飼養(yǎng)天數(shù);S0和S1分別為實(shí)驗(yàn)初魚尾數(shù)和實(shí)驗(yàn)?zāi)~尾數(shù)。

采用進(jìn)口IKA C5000氧氮式量熱計(jì)測(cè)定各樣品能值, 用KDN520全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定含氮量。能量收支模型[13]為C=P+F+R+U。式中,C為攝食能(攝食量×飼料能值);P為總生長能(終末魚體能量-初始魚體能量);F為糞便能(單位質(zhì)量糞便能值×糞便量);R為代謝能(通過上述公式計(jì)算, 即R=CP-F-U[14]);U為排泄能(通過氮收支差值計(jì)算, 即U=(CN-FN-PN)×24.83。其中CN為食物氮、FN為糞氮、PN為生長氮)。

2 結(jié)果

2.1 生長、飼料系數(shù)和成活率

從表 2可見, 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期, 各處理組錦鯉的成活率無顯著變化(P＞0.05), 24L組和18L∶6D組飼料系數(shù)顯著低于12L∶12D組、8L∶16D組和24D組(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)前30d內(nèi), 各處理組特定生長率無顯著變化(P＞0.05), 但隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長, 24L組、18L∶6D組和12L∶12D組錦鯉的特定生長率顯著高于8L∶16D組和24D組(P＜0.05)。從表 2可以看出, 在實(shí)驗(yàn)開始的前30d內(nèi), 實(shí)驗(yàn)魚的終末體重?zé)o顯著差異(P＞0.05), 從第45天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束, 24L組、18L∶6D組和12L∶12D組終末體重顯著高于8L∶16D組和24D組(P＜0.05), 24L組獲得最大體重(587.98±23.86) g, 24D組獲得最小體重為(429.61±19.73) g。

在實(shí)驗(yàn)期間, 各處理組錦鯉終末體重均有增加(圖 1), 但增長率不同, 在12L∶12D光處理?xiàng)l件下, 錦鯉終末體重的線性回歸方程的斜率為0.9755(圖 1A),24L組的錦鯉生長速度最快, 斜率為0.6491, 其次為18L∶6D組, 斜率為0.6320; 24D組的錦鯉生長速度最慢, 斜率為0.4291。

圖1 不同光照條件下錦鯉增重率的線性回歸分析Fig. 1 Linear regressive analysis of koi carp body weight increase rate in different light conditions

2.2 能量分配

表3為不同光照條件下養(yǎng)殖90d, 平均每克干物質(zhì)魚體攝食能在4種能量支出的分配比例。由表 3可見, 在不同光周期條件下, 攝食能分配在代謝能的比例最大, 其次是消耗在生長能。各組分配于代謝能和生長能的比例, 在24L∶0D、18L∶6D、12L∶12D和8L∶16D四組之間無顯著差異(P＞0.05),但在0L∶24D組存在顯著差異(P＜0.05), 分配于代謝能和生長能的比例明顯下降, 損失于排泄能和糞便能的比例最高(P＜0.05)。

表3 不同光照條件下錦鯉的能量總收支Tab. 3 Total energy budget of koi under different light conditions(%)

2.3 生物鐘相關(guān)基因表達(dá)量變化

由圖 2可見,Clock基因相對(duì)表達(dá)量在24L∶0D光周期條件下最高, 并顯著高于其他光照條件處理組(P＜0.05);Per2基因的相對(duì)表達(dá)量在18L∶6D光周期處理組最高, 但18L∶6D組與12L∶12D組、8L∶16D組、0L∶24D間無顯著差異(P＞0.05),Per2基因的相對(duì)表達(dá)量在24L∶0D組最小(P＜0.05);Cry1基因的相對(duì)表達(dá)量在24L∶0D和18L∶6D兩個(gè)光周期處理組不顯著, 且顯著高于其他光照處理組,Cry1基因的相對(duì)表達(dá)量在其他光照處理組依次為12L∶12D ＞ 8L∶16D ＞ 0L∶24D;Bmal1基因的相對(duì)表達(dá)量在各光周期處理組均無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 不同光照條件對(duì)錦鯉生物鐘基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 2 Effects of different light conditions on the relative expression of four biological clock genes in koi carp

3 討論

3.1 錦鯉幼魚生長的最適光周期

在自然環(huán)境中, 光周期作為重要的環(huán)境因子之一, 可以對(duì)硬骨魚類生長、代謝和繁殖產(chǎn)生重要的影響[1,2]。Hamed等[16]發(fā)現(xiàn)延長光照時(shí)間可以明顯改善斑馬魚(Danio rerio)的生長和繁殖性能[15]。異育銀鯽(Carassius auratus)在16L∶8D光周期條件下的最終體重、生長率和飼料利用率顯著高于其他光周期處理組, 大西洋鮭(Salmo salar)在連續(xù)光照條件下獲得最大體重[17], 鯉(Cyprinus carpio)在日光照大于6—9h時(shí)生長速度明顯加快。大多數(shù)魚類生活于10—12h的光周期環(huán)境[15]。在本實(shí)驗(yàn)中, 不同光周期(24L∶0D、18L∶6D、12L∶12D、8L∶16D和0L∶24D)處理45d后, 連續(xù)光照24L∶0D和較長光照18L∶6D、12L∶12D對(duì)錦鯉幼魚的終末體重、特定生長率的增加具有顯著影響(P＜0.05), 通過線性回歸分析, 終末體重的增長率最高, 說明不同的光周期對(duì)錦鯉生長具有一定的影響。據(jù)文獻(xiàn)分析, 絕大多數(shù)報(bào)道認(rèn)為長光照對(duì)魚類生長、發(fā)育和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)具有改善作用[3—5,7,10,15—18], 目前未見到延長光照時(shí)間超過12L會(huì)對(duì)魚類產(chǎn)生負(fù)影響的報(bào)道, 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與絕大多數(shù)報(bào)道觀點(diǎn)一致。此外, 多數(shù)魚類的實(shí)驗(yàn)研究通常會(huì)選擇為14L∶10D[15], Wilkinson等[19]發(fā)現(xiàn)調(diào)控光周期對(duì)虹鱒存活率并無顯著性影響。在本實(shí)驗(yàn)中, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期5種光照條件處理組錦鯉的成活率無顯著變化(P＞0.05)這一結(jié)論也與Bahram等[20]對(duì)波斯鱘(Acipenser persicus)和Edgar等[21]對(duì)墨西哥慈鯛(Cichlasoma beani)的研究相似, 但Windarti等[22]研究認(rèn)為, 在光照24D∶0L和18D∶6L條件下, 初始體重為約4 g的鰱(Hypophthalmichthys molitrix)經(jīng)過, 8周的養(yǎng)殖, 平均體重為98 g,較自然光周期條件下平均體重增加26 g, 這與本研究結(jié)果不同, 推測(cè)可能與魚類生活習(xí)性有關(guān), 鰱是一種夜行性魚類, 在黑暗的環(huán)境中較活躍, 因此連續(xù)黑暗更適合此類魚的生長。

3.2 光周期對(duì)能量收支的影響

許多研究表明, 光對(duì)魚類生理活動(dòng)產(chǎn)生多種影響, 魚類為了適應(yīng)生活環(huán)境變化, 會(huì)把機(jī)體攝入能量分配到生長、代謝及其他維持生命活動(dòng)的方面[23]。不同種類魚的能量收支機(jī)制有所不同, 即使是同種魚在不同攝食水平, 其能量分配情況也不同, 但是魚類攝入的總能量首先需要滿足基礎(chǔ)代謝, 而后剩余的能量才會(huì)促進(jìn)生長[24]。本研究錦鯉幼魚也呈現(xiàn)相同的情況, 5種(24L∶0D、18L∶6D、12L∶12D、8L∶16D和0L∶24D)光周期處理?xiàng)l件下, 攝食能分配在代謝能比例最大, 其次是分配在生長方面, 說明代謝能和生長能主導(dǎo)了錦鯉幼魚能量收支模式, 但在0L∶24D組, 出現(xiàn)代謝能和生長能顯著下降的現(xiàn)象, 說明光周期對(duì)錦鯉能量收支主要組分之間的比例關(guān)系有一定的影響, 即在連續(xù)黑暗條件下, 錦鯉幼魚用于代謝和生長的能量顯著減少, 以適應(yīng)黑暗環(huán)境, 這與林曉濤等[25]對(duì)光周期影響羅氏沼蝦幼體能量收支的報(bào)道結(jié)果一致。

3.3 光周期對(duì)Clock、Per2、Cry1和Bmal1基因的影響

光照、溫度、攝食水平和運(yùn)動(dòng)行為等多種環(huán)境因子都可被人、哺乳動(dòng)物、昆蟲、鳥類和植物的不同生物鐘基因系統(tǒng)識(shí)別。很多研究顯示, 對(duì)于生物鐘系統(tǒng)調(diào)控來說, 光周期、光照強(qiáng)度和光質(zhì)是影響生物鐘相關(guān)基因表達(dá)和晝夜節(jié)律變化的最重要的環(huán)境因子, 且光對(duì)生物鐘系統(tǒng)的調(diào)控呈現(xiàn)出特異性和保守性[26]。通過文獻(xiàn)分析, 魚類具有多種生物鐘基因存在, 其中研究最為廣泛的為Clock、Per2、Cry1和Bmal1等基因[27]。在本實(shí)驗(yàn)中, 研究了5種光照周期(24L∶0D、18L∶6D、12L∶12D、8L∶16D和0L∶24D)對(duì)錦鯉幼魚生物鐘基因Clock、Per2、Cry1和Bmal1表達(dá)的影響。結(jié)果表明,Clock和Cry1基因在連續(xù)光照24L∶0D和長光照18L∶6D條件下相對(duì)表達(dá)量較高, 但Per2在除連續(xù)光照24L∶0D處理?xiàng)l件外, 其他處理組相對(duì)表達(dá)量相近,此外,Bmal1基因表達(dá)量不受實(shí)驗(yàn)光照周期的影響。目前, 尚未見到光周期與生物鐘基因表達(dá)量作用的報(bào)道, 在相關(guān)領(lǐng)域的研究表明, 斑馬魚Per2和Cry1aa基因能直接受光周期調(diào)節(jié), 持續(xù)光照暴露與Cry1aa基因過量表達(dá)相同, 都能抑制生物振蕩(Biooscillation), 但生物振蕩在光暗循環(huán)實(shí)驗(yàn)條件下, 可顯著增強(qiáng), 使生物鐘基因的表達(dá)節(jié)律與晝夜變化同步[28]。研究發(fā)現(xiàn), 斑馬魚Per2基因啟動(dòng)子存在一個(gè)包含D-box和E/E,-box的光應(yīng)答模塊(LRM),Per2光應(yīng)答生物反應(yīng)與這個(gè)模塊相關(guān)[29]。可見, 光周期在調(diào)控生物鐘基因方面發(fā)揮重要作用。由于各種魚類生活環(huán)境和機(jī)體調(diào)控機(jī)制不同, 對(duì)光環(huán)境的適應(yīng)能力及光應(yīng)答反應(yīng)不同, 這也正印證了光對(duì)生物鐘系統(tǒng)調(diào)控具有特異性和保守型。

4 結(jié)論

本研究通過定期監(jiān)測(cè)不同光周期下錦鯉幼魚生長、能量收支及生物鐘基因相對(duì)表達(dá)量規(guī)律, 探究魚類對(duì)光照環(huán)境的生理反應(yīng)。在整個(gè)試驗(yàn)周期,各光周期處理組成活率無顯著變化(P＞0.05),24L組和18L∶6D組飼料系數(shù)顯著低于12L∶12D組、8L∶16D組和24D組(P＜0.05)。終末體重和特定生長率在實(shí)驗(yàn)前30d內(nèi)受光照影響不大(P＞0.05), 而實(shí)驗(yàn)30d后出現(xiàn)顯著變化, 延長光周期尤其是連續(xù)光照會(huì)顯著增加終末體重和特定生長率(P＜0.05);對(duì)比連續(xù)黑暗0L∶24D組, 其他光周期處理組錦鯉攝食能分配在代謝和生長的比例顯著增加(P＜0.05); 4個(gè)生物鐘相關(guān)Clock、Per2、Cry1和Bmal1基因相對(duì)表達(dá)水平無明顯規(guī)律。因此, 在錦鯉幼魚養(yǎng)殖過程中可以考慮延長光照或連續(xù)光照(18—24h/d)。本研究結(jié)果可為錦鯉幼魚的養(yǎng)殖提供參考。