溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎組織結構及抗氧化酶活性的影響

陳付菊 趙宇田 付生云 李雪源

(1. 青海大學農牧學院, 西寧 810016; 2. 青海省裸鯉救助中心, 西寧 810003)

水體中溶解氧(Dissolved oxygen, DO)作為影響魚類生命活動的重要指標, 與魚類的生長[1]、生殖[2]和能量代謝[3]等生命活動密切相關。然而水體環境中的DO水平常隨地理位置、季節、水流狀態和水體環境等變化而呈現出一定的波動性(4.0—7.4 mg/L)[4]。當水體中DO含量低于2.0 mg/L時, 魚會因低氧或缺氧表現出浮頭現象, 當DO含量低于1.0 mg/L時, 魚會出現嚴重浮頭甚至因缺氧而致死[5]。缺氧會影響魚類生理機能和器官形態結構[6], 而缺氧對其生理狀態和器官形態結構的影響與其體內活性氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)的累積密切相關。

線粒體被認為是氧濃度感受器, 也是產生ROS的重要細胞器[7]。當機體面臨急性或嚴峻缺氧時,細胞線粒體發生損傷, 線粒體蛋白質合成受阻, 數目減少, 嵴消失, 氧化力下降, 進而使線粒體產生過量的ROS[8], 過多的ROS會攻擊生物膜、蛋白質和核酸, 導致DNA、蛋白質和脂質的氧化損傷, 引發生物體生理機能改變、組織損傷及代謝紊亂等[9—11]。然而, 細胞內存在ROS清除系統如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)和過氧化氫酶(Catalase, CAT)等能夠清除過量ROS使細胞內ROS的產生與清除處于動態平衡狀態[12]。研究表明, 在低氧環境下, 線粒體通過ROS信號間接激活低氧誘導因子(HIF)而介導機體對低氧的適應[13]。因此, 以線粒體ROS為切入點研究細胞低氧響應對揭示高原土著動物低氧適應機制具有重要意義。

青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)作為青海湖中唯一的經濟魚類, 在青海湖整個生態系統中居于核心地位。自20世紀60年代初至90年代末, 由于自然環境的破壞和人為過度的捕撈, 導致青海湖裸鯉資源急劇下降。自21世紀開始, 青海省通過封湖育漁、增殖放流和修設洄游通道等資源保護措施使其數量恢復至8800萬千克, 但與原始蘊藏量的32萬噸仍有較大差距。2009年, 青海湖裸鯉在《中國物種紅色名錄》脊椎動物篇中被列為國家二級保護瀕危物種, 2010年被列為世界瀕危物種之一[14]。因此, 保護青海湖裸鯉資源具有非常重要的意義。

青海湖裸鯉長期生活在高海拔(3200 m)的低氧(溶解氧約6 mg/L)環境中, 對于環境溶解氧的波動表現出較強的耐受能力[15], 是研究低氧耐受機制的理想動物模型。然而, 截至目前對青海湖裸鯉的研究主要集中在鹽度適應特性[16—18]、繁殖特性[19]和腸道菌群[20,21]等方面, 而對其低氧耐受的研究較少見, 僅見低氧脅迫對青海湖裸鯉鰓組織結構的影響[15]。

腎作為魚類的主要排泄器官, 在清除魚類體內有害代謝產物過程中發揮重要的作用[22]。黃建盛等[23]和區又君等[24]發現, 急性低氧脅迫會造成軍曹魚(Rachycentron canadum)和卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)腎損傷, 提示腎對低氧敏感。因此, 本研究以青海湖裸鯉體腎為研究對象, 通過研究青海湖裸鯉在低氧脅迫下體腎線粒體超微結構及相關抗氧化酶活性的變化規律, 以期探討青海湖裸鯉低氧的適應能力, 為青海湖裸鯉的資源保護提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

性成熟的青海湖裸鯉取自青海湖黑馬河, 體長(24.11±0.12) cm, 體重(97.68±0.12) g。正式實驗前在室內暫養1周, 暫養水溫(14.5±0.7)℃, 水體DO維持在(8.4±0.1) mg/L(自然水體中的DO值), 即本實驗中為常氧, 正式實驗前1天停止進食。丙二醛(MDA)測定試劑盒(A003-1)、過氧化氫(H2O2)測定試劑盒(A064-1)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(A001-3)、谷胱甘肽過氧化物(GPX)測定試劑盒(A005-1)和總蛋白測定試劑盒(A045-2)均購自南京建成生物工程研究所; 組織線粒體分離試劑盒(C3606)、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(C2006)、Bradford蛋白濃度試劑盒(P0006C)均購自中國碧云天生物公司; 詹納斯綠B(J8020)購自北京索萊寶科技有限公司; 氯仿、無水乙醇等均購自天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 試驗設計

青海湖裸鯉中度和重度低氧脅迫均采用自制水族箱頂部覆蓋塑料膜, 水體充氮除氧方法而獲得。維持低氧期間, 利用AZ8402溶解氧測定儀定期監控水體溶解氧濃度, 參見文獻[25]。

實驗魚分成3組, 重度低氧組、中度低氧組和常氧組, 每組設置3個平行, 每組20尾。重度低氧組在1h內將DO從(8.4±0.1)降至(0.7±0.1) mg/L, 并維持24h; 中度低氧組在1h內將DO從(8.4±0.1)降至(3.0±0.1) mg/L, 并維持24h; 常氧組用氧泵將水體DO維持在(8.4±0.1) mg/L。在低氧脅迫結束后, 分別在中度低氧24h及重度低氧8h和24h時, 將魚用適量MS-222溶液麻醉, 迅速解剖后取體腎(1對), 用生理鹽水沖洗, 取左側體腎并提取線粒體用于膜電位的檢測(8尾/組); 取右側前1/3體腎, 4%多聚甲醛緩沖液(pH=7.4)固定用于組織結構的觀察(4尾/組); 取右側后1/3體腎, 2.5%戊二醛固定用于線粒體超微結構的觀察(4尾/組); 取左側和右側結合處體腎, 儲存于液氮用于抗氧化酶活性的檢測(8尾/組)。

1.3 試驗方法

體腎組織顯微結構的觀察用4%多聚甲醛固定后的體腎組織, 經50%、75%、85%、95%和100%的梯度酒精逐級脫水后, 二甲苯透明, 石蠟包埋, 用切片機(Leica RM 2135)切6 μm厚連續切片, 脫蠟以及梯度乙醇脫水, 蘇木精-伊紅(HE)染色, 自來水返藍、 脫水、 透明、 封片, 光學顯微鏡下觀察。

線粒體超微結構的觀察用2.5%戊二醛固定的體腎組織, 用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)洗滌3次, 每次5min。1%四氧化鋨固定1h, 梯度酒精脫水, 環氧樹脂包埋, 定位、超薄切片, 經醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色, 透射電鏡下觀察、拍照, 并統計桿狀線粒體比例(桿狀線粒體數/圓形線粒體數×100%)。

體腎抗氧化酶活性的測定將液氮保存的腎臟組織冰上解凍, 稱量, 按重量體積比1∶9 (g/mL)向樣品中加入生理鹽水, 并振蕩混勻后4℃離心10min(2500 r/min), 取上清液, 保存于-80℃冰箱暫存, 用于檢測抗氧化指標和蛋白濃度。

體腎線粒體的分離和線粒體膜電位的檢測按試劑盒說明進行線粒體分離, 取新鮮體腎組織(90 mg), 于預冷離心管(1.5 mL)內用剪刀剪碎后, 加入900 μL預冷的線粒體分離試劑A, 冰浴勻漿10次左右, 4℃離心5min(600 r/min), 將上清轉移到另一離心管中, 4℃離心(11000 r/min) 10min, 小心去除上清, 獲得沉淀物即線粒體, 用線粒體儲存液制備線粒體懸液并用Bradford蛋白濃度試劑盒檢測蛋白濃度和詹納斯綠B檢測線粒體活性。以上步驟均在冰上進行, 且不超過1h。

根據線粒體膜電位檢測試劑盒說明書進行線粒體膜電位的檢測, 在配置好的JC-1染色工作液中加入純化的線粒體, 用熒光酶標儀檢測線粒體膜電位的變化, 并計算相對熒光強度。相對熒光強度=綠色熒光強度/紅色熒光強度。檢測JC-1單體時, 激發光波長490 nm, 發射光波長530 nm; 檢測JC-1聚合物時, 激發光波長525 nm, 發射光波長590 nm。

1.4 統計分析

結果均采用平均值±標準誤(mean±SEM)表示,采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行單因素方差分析, 不同時間點的數據進行Duncan檢驗進行多重比較, 以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎顯微結構的影響

在光學顯微鏡下青海湖裸鯉體腎由腎小球、第一近曲小管、第二近曲小管、集合管和遠曲小管組成。常氧組體腎顯微結構正常, 腎小球和腎小管結構完整。第一近曲小管上皮細胞呈單層柱狀,管腔小而不規則, 第二近曲小管上皮細胞呈單層柱狀, 管腔呈圓形, 集合管上皮細胞呈單層立方形, 管腔不規則, 遠曲小管上皮細胞呈單層立方上皮, 管腔呈圓形, 管徑相對較大, 血管內含有紅細胞(圖 1A)。重度低氧8h(圖 1B)和24h(圖 1C)及中度低氧24h(圖 1D)脅迫對腎小球、近曲小管、遠曲小管及集合管結構均沒有影響。

圖1 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎顯微結構的影響Fig. 1 Effects of dissolve oxygen level on the body kidney microstructure of Gymnocypris przewalskii

2.2 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎線粒體超微結構的影響

透射電鏡觀察發現青海湖裸鯉常氧組體腎腎小管上皮細胞線粒體多呈圓形和橢圓形, 偶見有桿狀線粒體, 內有嵴, 線粒體膜完整(圖 2A); 重度低氧脅迫8h時線粒體多呈圓形和橢圓形, 偶見有細長的桿狀線粒體, 線粒體膜完整(圖 2B); 重度低氧脅迫24h時線粒體多呈桿狀和橢圓形, 線粒體膜和嵴完整(圖 2C); 中度低氧脅迫24h時線粒體多呈長桿狀,線粒體膜完整(圖 2D)。

圖2 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎線粒體超微結構的影響Fig. 2 Effects of dissolve oxygen level on the body kidney mitochondrial ultrastructure of Gymnocypris przewalskii

通過統計桿狀線粒體比例后發現, 重度低氧脅迫8h時體腎桿狀線粒體比例與常氧組差異不顯著(P＞0.05); 中度和重度低氧脅迫24h時體腎桿狀線粒體比例顯著增加(P＜0.05; 圖 3)。

圖3 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎桿狀線粒體比例的影響Fig. 3 Effects of dissolve oxygen level on proportion of rodshaped mitochondria in the body kidney of Gymnocypris przewalskii

2.3 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎線粒體膜電位的影響

由圖 4可見, 體腎線粒體綠色熒光與紅色熒光強度比值在重度低氧脅迫8h時升至最大(P＜0.05),24h時降低(P＜0.05), 但重度低氧8h和24h時其比值均高于常氧組(P＜0.05); 中度低氧24h時體腎線粒體綠色熒光與紅色熒光強度比值顯著高于常氧組(P＜0.05), 但與重度低氧24h時差異不顯著(P＞0.05)。這表明重度低氧脅迫使體腎線粒體膜電位呈先降低后增加的變化趨勢, 中度低氧使體腎線粒體膜電位降低。

圖4 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎線粒體膜電位的影響Fig. 4 Effects of dissolve oxygen level on the body kidney mitochondrial membrane potential of Gymnocypris przewalskii

2.4 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎抗氧化酶活性的影響

由圖 5可知, 體腎H2O2含量在重度低氧脅迫8h時最大(P＜0.05), 24h時降低(P＞0.05), 且重度低氧24h時其含量與常氧組間差異不顯著(P＞0.05); 中度低氧脅迫24h時H2O2含量升高, 但與常氧組間差異不顯著(P＞0.05; 圖 5A)。體腎MDA含量在重度低氧脅迫8h時最大(P＜0.05), 24h時降低(P＞0.05), 且重度低氧8h和24h時其含量均高于常氧組(P＜0.05); 中度低氧脅迫24h時MDA含量顯著高于常氧組(P＜0.05), 但與重度低氧8h和24h時差異不顯著(P＞0.05; 圖 5B)。

體腎SOD活性在重度低氧脅迫8h時最大(P＜0.05),24h時降低(P＞0.05), 且重度低氧8h和24h時其活性均高于常氧組(P＜0.05); 中度低氧脅迫24h時SOD活性與常氧組間差異不顯著(P＞0.05; 圖 5C)。體腎TAOC在重度低氧脅迫后持續增加, 且均高于常氧組(P＜0.05), 但重度低氧8h和24h間T-AOC差異不顯著(P＞0.05); 中度低氧脅迫24h時T-AOC顯著高于常氧組(P＜0.05; 圖 5D)。體腎GPX活性在重度低氧8h時最大, 24h時稍降低, 但重度低氧8h和24h時其活性均高于常氧組(P＜0.05); 中度低氧脅迫24h時GPX顯著高于常氧組(P＜0.05), 但與重度低氧8h和24h間其活性差異不顯著(P＞0.05; 圖 5E)。

圖5 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎H2O2 (A)、MDA (B)、SOD (C)、T-AOC (D)和GPX (E)活力的影響Fig. 5 Effects of dissolve oxygen level on H2O2 (A), MDA (B), SOD (C), T-AOC (D) and GPX (E) activities in the body kidney of Gymnocypris przewalskii

3 討論

3.1 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎顯微結構的影響

魚類的窒息點可以反映魚類對DO的最低需求量。劉濟源等[16]研究顯示, 4齡性成熟青海湖裸鯉的窒息點為0.14—0.17 mg/L, 除鯽(Carassius auratus)的窒息點(0.11—0.13 mg/L)外, 其他鯉科魚類的窒息點均大于青海湖裸鯉。Matey等[15]研究顯示, 青海湖裸鯉在急性低氧(0.3±0.1 mg/L)可存活24h, 說明青海湖裸鯉具有很強的低氧耐受能力。本研究發現, 青海湖裸鯉在低氧(0.3±0.1 mg/L)脅迫8h后其死亡率高達40%, 但在低氧(0.7±0.1 mg/L)脅迫8h后其死亡率降至15%以下, 低氧(3.0 mg/L)脅迫可存活數天。故本研究采用0.7 mg/L為重度低氧脅迫濃度, 3.0 mg/L為中度低氧脅迫濃度。

體腎作為魚類的主要排泄器官, 在清除魚類體內有害代謝產物過程中發揮重要的作用[22]。黃建盛等[23]和區又君等[24]發現, 急性低氧脅迫會造成軍曹魚(Rachycentron canadum)和卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)腎損傷, 使其機能紊亂。邵川等[26]研究顯示,慢性間歇性低氧可導致大鼠腎臟組織細胞水腫變性和超微結構異常。戴玉等[27]研究顯示, 急性低壓缺氧導致大鼠腎臟功能和結構造成損傷, 表明腎臟也是一個對缺氧十分敏感的器官, 很容易受到缺氧性損傷。組織和器官的結構變化被認為是病理損傷的最初表現, 也是快速檢測生物機體應激反應的方法之一[28]。在本研究中, 重度(0.7±0.1) mg/L和中度(3.0±0.1) mg/L低氧脅迫對青海湖裸鯉體腎組織結構沒有影響, 表明重度和中度低氧并未造成體腎組織結構的損傷。目前無低氧脅迫后魚類體腎組織結構變化的參考對比文獻, 本實驗室前期研究結果顯示, 重度低氧使肝細胞出現空泡化, 且隨低氧脅迫時間延長肝細胞空泡變性更嚴重, 且部分線粒體出現空泡化。作者認為, 青海湖裸鯉長期生活在高海拔的低氧環境中, 經過長期的自然適應, 對高原低氧水環境具有較強的耐受潛力, 但不同組織對低氧的耐受性及響應時間可能不同。

3.2 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎線粒體超微結構和膜電位的影響

線粒體是細胞利用氧并合成ATP的主要場所,對缺氧最敏感。缺氧可導致組織、細胞發生一系列結構改變。研究顯示, 缺氧情況下最敏感的是線粒體和內質網[29]。在本研究中, 重度和中度低氧脅迫對青海湖裸鯉體腎腎小管上皮細胞線粒體超微結構沒有影響, 但低氧脅迫后線粒體形態以桿狀居多, 其原因不明。陳世喜等[30]認為, 在低氧脅迫后,水體環境中的低DO水平將導致有氧呼吸水平下降,為提供足夠能量, 線粒體功能應該增強。本研究中,低氧脅迫后桿狀線粒體的增多是否與增加其呼吸功能有關則有待進一步研究探討。

線粒體氧的生成和利用首先通過線粒體呼吸鏈復合體形成跨內膜兩側的膜電位, 后者通過復合體Ⅴ轉化為ATP。因而線粒體膜電位是衡量線粒體健康水平的重要標準[31]。在急性腎損傷時, 腎臟組織由于供氧不足, 從而使線粒體ROS清除能力顯著下降, 導致細胞和線粒體發生氧化應激[32], 過量的ROS沉積可導致線粒體膜電位的喪失[33]。本研究中, 重度低氧脅迫8h時青海湖裸鯉體腎線粒體膜電位急劇降低, 24h時膜電位又升高。本試驗結果表明, 低氧脅迫下, 青海湖裸鯉體腎線粒體膜電位應激性下降, 但隨著低氧脅迫時間的延長, 體腎線粒體膜電位逐漸升高, 可能與增加其呼吸功能有關。低氧脅迫后體腎線粒體膜電位的急劇降低可能與低氧應激導致的體腎ROS增加有關。

3.3 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎組織氧化應激水平的影響

機體受到低氧脅迫后線粒體內ROS產生迅速增加, 而未被及時清除的過量ROS容易導致機體氧化應激損傷, 故線粒體內ROS的水平能夠反映細胞內的氧化應激水平, 但因ROS壽命短暫, 并且缺乏足夠敏感的技術直接檢測生物體內的ROS, 通常通過檢測體內H2O2含量來間接反映細胞發生脂質過氧化的程度[34]。在本研究中, 體腎H2O2含量在重度低氧脅迫8h時顯著增加, 24h時降至正常水平, 表明水環境中DO驟然降低后對青海湖裸鯉產生脅迫,從而導致ROS大量產生, 裸鯉可通過自身調節能在24h內使體腎ROS恢復到原來的水平。研究表明, 在低氧環境下, 線粒體通過ROS信號間接激活低氧誘導因子(HIF)而介導機體對低氧的適應[13], 低氧脅迫后青海湖裸鯉ROS信號通路有待進一步研究。

MDA是自由基和多不飽和脂肪酸反應產生的環氧化合物, 可作為氧化的一個指標, 反映機體脂質過氧化程度[35]。在本研究中, 低氧脅迫使體腎組織MDA含量增加, 且隨低氧脅迫時間延長MDA含量呈降低趨勢。這與陳世喜等[30]對卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)幼魚肝的研究結果相似。本試驗結果表明,在低氧脅迫初期, 青海湖裸鯉體腎內ROS應激性增加, 從而使MDA含量升高, 但隨著低氧脅迫時間的延長, 體內抗氧化酶持續清除ROS, 進而使MDA含量降低, 從而避免低氧脅迫對體腎組織造成損傷,這與低氧脅迫并未造成青海湖裸鯉體腎組織結構和線粒體超微結構損傷的結果相吻合。

3.4 溶解氧水平對青海湖裸鯉體腎抗氧化能力的影響

過量ROS容易導致機體氧化應激損傷, 但線粒體內存在ROS清除系統能夠清除過量的ROS, 從而避免ROS累積造成的機體損傷。SOD、GPX和TAOC是清除體內多余自由基的重要抗氧化酶, 代表和反映機體抗氧化酶系統和非酶系統的代償能力及機體自由基的代謝狀態[36]。在本研究中, 體腎中T-AOC和GPX在低氧脅迫后顯著增加, 這與賈秀琪等[37]對河川沙塘鱧(Odontobutis potamophila)腎的研究結果一致。本試驗結果表明, 當裸鯉受到低氧脅迫時, 體腎中ROS應激性增高, T-AOC和GPX響應性增高以清除過多的ROS, 從而保護體腎免受ROS損傷。在本研究中, 重度低氧脅迫后體腎中SOD活性呈先增加后降低的趨勢, 中度低氧脅迫后SOD活性與常氧組差異不顯著。陳世喜等[30]研究發現, 卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)幼魚肝組織SOD活性在急性低氧脅迫3h時最大, 后逐漸降低,8h和24h時降至正常水平, 這與本研究的變化趨勢相似。本試驗結果表明, 在低氧脅迫早期, 體腎中ROS含量應激性增高, SOD活性響應性增強以清除過多的ROS, 但隨著體腎內ROS含量的降低,SOD活性也隨之降低。

綜上所述, 中度低氧(3.0±0.1) mg/L和重度低氧(0.7±0.1) mg/L脅迫引起青海湖裸鯉體腎組織發生氧化應激反應, 但并未造成體腎組織結構和線粒體結構的損傷, 低氧脅迫下體腎線粒體形態和抗氧化酶活性發生明顯變化, 推測體腎可能通過調整線粒體形態及相關抗氧化酶活性來更好地應對溶氧變化。本研究為探討青海湖裸鯉裸鯉低氧適應機制提供理論依據。