臍帶來源的華通氏膠間充質干細胞的分離、特性及應用前景

丁 賽，張紅霞，朱海英

(海軍軍醫大學基礎醫學院細胞生物學教研室，上海 200433)

間充質干細胞最早在骨髓中被發現和鑒定，隨后在人體胚胎及成體的多種組織中被陸續鑒定出來，這些組織主要包括成體骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、臍帶和臍帶血等。研究表明，間充質干細胞的組織來源雖然不同，但是鑒于其共同的干細胞特性和免疫調節能力，其展現出的臨床應用前景受到人們的格外關注。目前，臨床應用方面研究較多的是骨髓來源的間充質干細胞，但其制備過程不容易進行質量控制，取材時對患者有損傷；其免疫原性強，不適用異體移植；還有，細胞數量、增殖能力以及分化潛能與供體的年齡均呈負相關，這都限制了骨髓間充質干細胞的臨床應用。與之相比，胎盤和臍帶組織中分離出的間充質干細胞不僅保持了間充質干細胞的生物學特性，而且分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制、易于工業化制備等特征，所以有可能成為更具臨床應用前景的多能干細胞[1]。

華通氏膠間充質干細胞(Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells，WJ-MSCs)是一種分離自臍帶華通氏膠的間充質干細胞，其基因表達譜符合目前對MSCs 的界定，也表達一定水平的OCT-4、SOX-2和NANOG等多能性基因，除了能分化為成骨、成脂、成軟骨細胞外，還能分化成內胚層和外胚層衍生細胞。此外，WJ-MSCs 不表達MHC-II，免疫原性很低，并在體內表現出免疫調節特性，這使得它們成為細胞療法中同種異體和異種移植的良好替代物。因此，WJ-MSCs是一種很有臨床應用前景的間充質干細胞。

1 華通氏膠間充質干細胞的分離、建系和增殖特性

臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)可以從整個臍帶獲得，但原代培養時可能會有血管內皮細胞等其他細胞混雜，造成細胞系不易純化；也可以從臍帶的不同區室分離建系，這些部位包括臍靜脈的內膜下層、臍帶內層、華通氏膠和及其血管周圍區[2]。其中，WJMSCs 含量最為豐富。華通氏膠位于血管之間、血管與外膜之間，是一種膠狀物。

既往文獻報道[3]，華通氏間充質干細胞的分離方法主要包括酶消化法和組織塊培養法。

1.1 酶消化法分離華通氏膠間充質干細胞

無菌條件下取剖腹產新鮮臍帶，用無菌PBS溶液洗去臍帶殘留血液，一直到整個組織塊變白為止。選取其中部5~7.5 cm，剪成若干臍帶小段(每段長2~3 cm)，縱行剖開每段臍帶，去除其中的動靜脈、外層羊膜，留取華通氏膠組織(即血管之間以及血管與外膜之間的凝膠狀物)。將其剪切成1 mm3以下的小塊，再以平衡鹽溶液沖洗后，浸于濃度為0.2%的Ⅰ型膠原酶溶液中，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中孵育45 min~2 h，消化后的混合液用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基終止消化，反復吹打后將懸浮液移入離心管，離心收集細胞。用新培養液懸浮細胞，接種于細胞培養瓶或培養皿，置37 ℃、CO2體積分數為5%、98%濕度的培養箱培養，待細胞貼壁后更換完全DMEM培養基溶液，以后每隔3 d 換液1 次，細胞貼壁融合后傳代培養。

1.2 組織塊貼壁法分離華通氏膠間充質干細胞

取出華通氏膠組織，剪成體積為3~5 mm3的小塊，并用無菌解剖溶液再次清洗。后將組織塊轉移至細胞培養瓶中，平鋪，并加入DMEM/F12培養液中(含10% FBS、100 μg/mL鏈霉素以及100 U/ml青霉素)，靜置于CO2體積分數為5%、37 ℃的培養箱中培養。然后每天用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況(新生細胞具有貼壁生長的特性)，待華通氏膠組織塊附著后，每2~3 d更換培養基。大約7~10 d后，可以分離出具有間充質干細胞表型的細胞。顯微鏡下觀察，細胞為典型的成纖維樣細胞，為梭形或星狀，呈平行或旋渦狀排列。

比較兩種方法，組織塊貼壁法在分離WJ-MSCs 時可以作為首選的方法。雖然其首次傳代所用時間較長，但分離方法更易于保持人臍帶間充質干細胞的活性，且獲得的細胞純度高、細胞活力好，同時費用低，生物污染的可能性低[4]。酶消化法雖然首次傳代所用時間較短，獲得的細胞量更多，但費用高，細胞純度不高，對細胞質量影響較大[5]。另外，兩種方法所獲得的WI-MSCs的免疫表型和多系分化能力無顯著差異[6]。

有研究小組將人臍帶分為不同的區室，如羊膜上皮膜(amnion，AM)、臍 帶 內 膜(subamnion，SA)、華 通 氏 膠(Wharton's jelly，WJ)和臍血管周圍區域(perivascular，PV)。對比從臍帶不同區室分離的細胞數量，華通氏膠中獲得的MSCs是最高的，每厘米臍帶的華通氏膠中可分離的活細胞數可達4.7×106個[7]。與其他區室相比，華通氏膠具有最大的表面積和體積，且細胞松散地位于華通氏膠內，所以無需酶處理就可快速分離細胞。由于其較短的群體倍增時間，因此僅需短期培養即可產生足夠數量的細胞。

2 華通氏膠間充質干細胞的分化潛能

根據國際細胞治療協會(International Society for Cellular Therapy，ISCT)的定義，WJ-MSCs 符合目前定義間充質干細胞的最低標準，即在標準培養條件下貼壁生長，特異性表面抗原 CD105、CD73 和CD90 陽 性，且CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19 和HLA-II 陰性的細胞占群體的95%[8]，同時具有分化成脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞譜系。已經有較多實驗證明WJ-MSCs具有MSCs共同的三向分化潛能[7，9]。但另一方面，與其他組織來源的MSCs 相比，WJ-MSCs 的三向分化潛能又有其特點，比如Karahuseyinoglu 等[10]所證明，與骨髓來源的間充質干細胞相比，WJ-MSCs具有更大的向軟骨和成骨譜系分化的潛力，但向脂肪細胞分化的能力稍弱。與來自于臍帶不同區室的MSCs 相比，WJ-MSCs 向脂肪分化的能力無差異，但是卻顯示出較強的骨和軟骨分化能力。研究結果顯示，與臍帶PV、SA和AM來源的MSCs相比，暴露于骨細胞分化培養基的WJ-MSCs 顯示出最多數量的馮庫薩(Von Kossa)染色細胞和最大的結節染色強度。與臍帶SA 和AM 來源的MSCs 相比，暴露于軟骨細胞分化培養基的WJ-MSCs 和PV 來源的MSCs 顯示出更多阿利新藍(Alcian blue)染色陽性細胞。骨細胞標記基因骨鈣素、骨橋蛋白、堿性磷酸酶和骨涎蛋白在WJ-MSCs 中的表達水平顯著高于PV、SA 和AM 來源的MSCs。類似地，與臍帶PV、SA和AM來源的MSCs相比，WJ-MSCs中軟骨細胞標記基因II型膠原、軟骨寡聚基質蛋白、纖維調節蛋白和性別決定區Y 框蛋白9 的表達水平顯著高于PV、SA 和AM 來源的MSCs(表1)[7，11]。

表1 人臍帶不同區室的MSCs的成脂、成骨和成軟骨分化評分

從胚胎發育上看，華通氏膠中的基質細胞來自胚外中胚層[12]，但目前的研究結果表明除了具有向中胚層衍生細胞分化外，WJ-MSCs還具有更廣泛的分化潛能，能夠向內、外胚層細胞及其衍生細胞分化。

2.1 WJ-MSCs向內胚層及衍生細胞分化

誘導WJ-MSCs 向內胚層衍生細胞分化，是一種跨胚層的分化方向。到目前為止，已經有較多的報道證明WJ-MSCs 具有肝向和胰腺細胞分化的潛能[13]。其中Zhang等[14]報道了使用肝細胞生長因子和成纖維細胞生長因子4 誘導WJ-MSCs 向肝分化，結果顯示，誘導的細胞表達肝細胞特異性標志物，如白蛋白、人甲胎蛋白和細胞角蛋白18，同時糖原染色呈現陽性，表明這些細胞能夠儲存糖原。Zheng 等[15]報道了，通過肝源性分化方案將WJ-MSCs 誘導分化為功能性肝樣細胞，經檢測，誘導后的細胞表達肝血清蛋白，如總蛋白、白蛋白、球蛋白和甲胎蛋白，同時糖原高碘酸—希夫染色陽性，而且細胞可攝取低密度脂蛋白。Bharti等[9]還證明了向肝細胞分化后，獲得的細胞具備了氨代謝和產生尿素的能力。

WJ-MSCs 向胰腺細胞方向分化也獲得了成功。WJ-MSCs細胞在神經元條件培養基和干細胞條件培養基培養后，細胞由長梭形逐漸變圓，并聚集成團。經檢測，誘導后的細胞表達胰島及胰腺β細胞相關基因，如PDX1、HLXB9、NKX2.2、NKX6.1和GLUT-2等，將這些分化的細胞移植入糖尿病大鼠模型，可明顯降低血糖水平，有效改善體質量減輕癥狀，并且不會發生移植排斥反應，表明WJ-MSCs 可分化成成熟的胰島β樣細胞，該細胞含有胰島素原的C肽，能對血糖變化作出反應并釋放胰島素[16]。

2.2 WJ-MSCs向中胚層及衍生細胞分化

由于WJ-MSCs 來自于中胚層，所以體外誘導WJ-MSCs 向中胚層譜系的細胞分化，到目前已經有了很多成功的例子。除了成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞外，心肌細胞、骨骼肌細胞或內皮細胞也有較多成功的報道。

使用5-氮胞苷或心肌細胞條件培養基培養WJ-MSCs，檢測到心肌肌鈣蛋白I和N-鈣黏蛋白的表達，可以觀察到誘導分化后的細胞產生自律性搏動，由此證明了WJ-MSCs能分化成心肌細胞，并認為WJ-MSCs可作為心肌細胞的候選種子細胞[17]。

Conconi等[18]分選了CD105+/CD31-/KDR-WJ-MSCs，在培養基中添加馬血清和雞胚提取液，證明了WJ-MSCs 中的CD105+細胞能夠在體外分化成表達肌源性因子5和成肌調節因子的骨骼肌細胞，而且能在動物體內參與到骨骼肌修復當中。

Wu等[19]進行的研究表明，在血管內皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子存在下，WJ-MSCs分化為內皮細胞并表達成熟的內皮細胞標記物，如CD31或CD34。分化后的細胞還獲得了內皮細胞功能，能夠攝取乙酰化低密度脂蛋白。

2.3 WJ-MSCs向外胚層及衍生細胞分化

多項研究中均檢測到了WJ-MSCs 表達神經元特異性核蛋白，這提示了WJ-MSCs具有神經方向分化的內在潛力[20-21]。許多研究也證明了不同的誘導條件能成功誘導WJ-MSCs 向神經方向分化。

Fu 等[20]通過使用神經元條件培養基培養WJ-MSC，在誘導后第9天檢測到神經元特異性標記物的高表達和隨后的形態學變化，表達神經纖維蛋白等神經元標志性蛋白的細胞比例達到87%。Mitchell等[21]利用堿性成纖維生長因子、丁基化羥基茴香醚和二甲基亞砜進行多步驟神經方向誘導，使WJ-MSCs 轉分化為具有神經元的形態，并且表達β-III微管蛋白、神經絲、神經元特異性烯醇化酶和酪氨酸羥化酶等兒茶酚胺能神經元的標志。

利用小分子化合物也能誘導WJ-MSCs 的神經方向分化。Nan 等[22]利用優化濃度的川芎嗪在6 h 內將WJ-MSCs 誘導分化為表達神經特異性蛋白的神經元樣細胞。這些神經特異性蛋白包括比如烯醇(化)酶，神經纖維蛋白和膠質纖維酸性蛋白，形態也有顯著變化，呈現神經細胞體外生長的典型特征。另一方面，Liang 等[23]報道了WJ-MSCs 可以在體外快速分化為膽堿能樣神經元。

另外，Hu 等[24]報道了WJ-MSCs 能夠在體外分化為視網膜祖細胞。視網膜祖細胞胚胎發育上起源于神經外胚層細胞。Hu等在無血清神經干細胞條件培養基中添加了Dkk-1 和LeftyA，前者是Wnt/β-catenin 途徑拮抗劑，后者是Nodal 信號通路拮抗劑。誘導后的WJ-MSCs 由梭形轉變為具有眾多突起的球狀細胞，表達視網膜祖細胞標志物Pax6和Rx，巢蛋白表達下調。

精子樣細胞在胚胎發育中也屬于外胚層衍生細胞。Huang等[25]用全反式維甲酸、睪酮和睪丸細胞條件培養基將WJ-MSCs誘導分化為具有蝌蚪形態的精子樣細胞，該細胞表達生殖細胞特異性標記物Oct4、CD117(C-kit)、CD49f、Stella(DDPA3)或Vasa(DDX4)。

3 WJ-MSCs的應用展望

作為間充質干細胞家族的一個成員，與骨髓間充質干細胞相比，WJ-MSCs的研究雖然仍處于起步階段，但已有的研究表明其具有獨特的生物學特性。相信隨著研究的深入，WJ-MSCs在將來會有更廣泛的臨床應用。另外，WJ-MSCs不表達MHCII，并具有獨特的免疫調節特性[26]，這使得它們非常適合同種異體和異種移植。不僅如此，目前已經使用WJ-MSCs 進行了許多臨床前和臨床研究[27]，也已經有研究表明WJ-MSCs可以改善心血管疾病、免疫相關疾病或神經系統疾病患者的狀況。動物研究表明，WJ-MSCs可以改善帕金森氏病、組織纖維化、癌癥和脊髓損傷等臨床癥狀，其機制可能在于其多向分化潛能，能夠分化成受損組織的細胞，也可能是進入體內后，其獨特的旁分泌機制起到重要作用[28]。再者，對臨床應用而言，最重要的是其安全性。Gauthaman 等[29]的研究證明，WJ-MSCs 在移植到體內后不誘導腫瘤發生或機體的炎癥反應，這說明在將來臨床應用的安全性方面，WJ-MSCs比胚胎干細胞和誘導性多能干細胞更有優勢。因此，WJ-MSCs是再生醫學領域的又一個具有應用潛力的間充質干細胞。當然，Paladino 等[30]的研究結果也提出了一個值得關注的問題，WJ-MSCs的衰老會影響其在體內的免疫調節作用，Luo 等[31]的研究結果也提示衰老的人臍帶間充質干細胞肝向分化效率也會下降，所以應用到臨床前仍要對細胞的生理狀態進行全面評估。