肝纖維化發生及逆轉途徑的研究進展

蘇 靜，胡以平

(海軍軍醫大學細胞生物學教研室，上海 200082)

肝病是一項全球范圍內引起廣泛關注且非常嚴重的公眾健康問題，全世界每年約有200萬人死于肝病[1]。引起肝病的潛在病因主要包括病毒，代謝，藥物毒性，自身免疫等，持續的刺激使得患者從最初的慢性肝損傷逐步發展到晚期肝硬化甚至肝癌。在慢性肝損傷中多伴隨著肝纖維化，而進行性肝纖維化的一個共同結果是肝硬化，其中中國占全球肝硬化死亡人數的11%[2]?，F階段，晚期肝病的治療手段依舊主要依賴器官移植，但受其資源限制性，晚期肝病的治療面臨許多困難。目前在早期實驗和臨床研究中已經發現了肝纖維化的可逆現象，如果臨床治療中能提前發現并在此階段進行肝纖維化的逆轉干預，將對肝病治療具有重大意義。本文就目前肝纖維化逆轉的主要進展進行綜述，以期為肝纖維化相關疾病的治療和進一步研究提供理論指導。

1 肝纖維化發生的病理生理機制

肝纖維化是肝臟在受到外界刺激后發生的自我修復和傷口愈合，這是一個復雜的多細胞反應的結果。國內肝病多數是由于大量飲酒和慢性乙型、丙型病毒性肝炎感染引起的，但不管是何種病因，肝纖維化的形成過程非常相似，主要包括長期慢性實質損傷，持續激活炎癥反應和氧化應激，細胞外基質大量沉積，纖維瘢痕形成等，共同破壞肝臟的正常結構和功能[3]。

纖維化的發生始于效應細胞的激活。肝臟受到損傷后，肝內細胞的死亡以及免疫細胞的浸潤引起炎癥和纖維化信號的級聯反應激活。細胞損傷會釋放危險相關分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，是一種細胞內異質分子，如游離DNA、ATP、核因子(high mobility group protein B1，HMGB1)，熱休克蛋白等，或許還有病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPS)[4]，如 酒 精，革蘭氏陰性菌脂多糖(LPS)等，這些相關模式刺激并激活一些炎癥細胞如巨噬細胞、T 細胞、自然殺傷細胞(natural killer T cell，NKT)、庫普弗細胞等，分泌如白介素(interleukin，IL)-1β、-18、-13， 干 擾 素γ， 腫 瘤 壞 死 因 子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α) 等 促 炎 因 子 和CCL2(C-C motif chemokine ligand 2)等趨化因子，進一步誘導淋巴細胞，單核細胞等在損傷處的募集和激活。在炎癥微環境下，肌成纖維細胞活化和增殖，并在趨化因子的作用下遷徙，肌成纖維細胞是產生細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的主力來源。肌成纖維細胞的來源可根據病因的不同，大致分為4種，以靜息期的肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)激活分化為主，α-平滑肌肌動蛋白(actin alpha 2，α-SMA)和I型膠原的表達增加是活化的肝星狀細胞(activated hepatic stellate cells，aHSCs)的特征標志；還有內源性門靜脈成纖維細胞、骨髓來源細胞和肝實質細胞來源，可經過上皮間充質轉換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)產生肌成纖維細胞，通過分泌細胞外基質蛋白等對肝纖維化進展產生重要作用。

在進展性肝慢性損傷中[5]，ECM 的生成降解平衡狀態被打破而大量沉積是肝纖維化的重要特征?；罨木奘杉毎⒏涡菭罴毎?，以及其他肌成纖維細胞可以釋放腫瘤生長因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)，TGF-β1 是誘導纖維膠原(主要是I 型和III 型)、α-SMA、層黏連蛋白和纖維連接蛋白產生的最有效的細胞因子，同時該因子也會促進肌成纖維細胞存活和增殖。肝星狀細胞可以分泌基底膜蛋白酶、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)包括MMP-2、MMP-3和MMP-9和間質膠原酶MMP-13，aHSCs可以分泌金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteases，TIMP)1和2。MMPs是一種鈣依賴性酶，能特異性降解膠原和非膠原性ECM底物，而在肝損傷期間金屬蛋白酶組織抑制劑的持續產生可以抑制基質金屬蛋白酶的活性，使得金屬蛋白酶對多余的纖維膠原去除效率降低，打破基質降解合成的平衡，從而促進細胞外基質的沉積。

在肝纖維化的典型特征中，除了ECM的大量沉積，還會發生竇道毛細血管化，這主要是由于HSC激活后，合成和釋放血管生成介質，如VEGFA(vascular endothelial growth factor A)，PDGF(platelet derived growth factor)等，同時分泌纖維膠原I 和III 在剝離間隙中取代IV 型膠原引起的；膽管反應，在慢性肝損傷的情況下，持續的炎癥和氧化應激使得肝細胞增殖和肝干細胞分化被抑制，短暫擴增的肝祖細胞被迫主要分化為激活和應激抵抗的膽管樣細胞或反應性膽管細胞。

2 肝纖維化的可逆性分析

目前肝纖維化的逆轉已經在許多實驗研究和臨床治療中得到驗證。 大量的基礎研究， 包括四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)，硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)，膽管結扎等誘導的動物肝纖維化模型[6]，以及豐富的臨床治療數據[7]，均展示了不同病因引起的慢性肝病中出現肝纖維化消退現象。正如在大鼠慢性CCl4損傷中，晚期肝纖維化在損傷停止后被重塑到接近未損傷肝的水平[8]；Poynard 等[9]報告，所有慢性丙型肝炎患者在治療后纖維化發生率均有下降。

在肝纖維化的逆轉過程中，標志性特點是膠原纖維降解，肌成纖維細胞、炎癥和纖維化細胞因子減少，肝功能改善以及肝生理結構的恢復。具體體現在，在去除肝臟外界刺激的影響下，由于肝臟本身的再生能力影響和肝壞死細胞的減少，使得炎癥因子和促纖維化因子分泌也減少，同時活化的肝星狀細胞會逐漸走向衰老和凋亡，或轉為靜息狀態，TGF-β和TIMP1表達水平降低，MMPs活性增加，加快ECM降解，促進肝臟ECM的重塑。

3 肝纖維化逆轉途徑研究

3.1 減少活化的肝星狀細胞數量

在正常肝臟中，HSCs約占肝駐留細胞總數的15%和肝非實質細胞的30%，通常表現為靜息狀態并含有脂滴[10]。但在肝臟受到損傷時，不同炎癥因子導致HSCs 激活或轉分化為具有高度增殖性和收縮性的肌成纖維細胞，持續的HSCs 激活釋放的細胞因子可增強炎癥和纖維化組織反應。目前靶向HSCs 的治療已經取得了較多成果，主要有兩種治療方法。

3.1.1 促進HSCs 衰老和凋亡利匹韋林(Rilpivirine，RPV)，是一種抗逆轉錄病毒藥物，在肝臟毒性和脂質特性方面更具有安全性。研究者已在細胞和實驗動物層面證明RPV 能夠通過JAK-STAT 通路調節STAT1 (signal transducer and activator of transcription 1)和STAT3 之間的平衡，通過STAT1 的選擇性調控誘導HSCs 凋亡，可在不同的慢性肝損傷實驗模型中，改善炎癥和肝纖維化，凋亡HSCs 分泌的IL-6 還能特異性激活肝細胞中STAT3，以增強肝再生[11]。aHSCs 還具有以NF-kB(nuclear factor kappa B)依賴的方式增強生存率的特征，從而促進纖維化，因此，抑制NF-kB 通路可能通過誘導HSCs 凋亡來抑制肝纖維化[12]。除此之外，CCN家族基質細胞蛋白，富含半胱氨酸的蛋白61(CCN1/CYR61)通過減弱TGF-β信號通路來促進HSCs的衰老和凋亡[13]。纖維連接蛋白肽[14]可以通過aHSCs 凋亡導致自限性反應，最終限制慢性纖維化的發展。

3.1.2 抑制或逆轉HSCs 活化成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)是在肝損傷中表達增加的主要生長因子家族之一，FGF信號除了加速損傷肝臟的再生外，還會導致纖維化的發展。研究表明CCL4誘導的肝纖維化在FGF1/FGF2 缺陷小鼠中顯著降低[15]；2020 年Wang 等[16]的研究再次證明，抑制FGFR(fibroblast growth factor receptors)信號通路通過抑制促炎細胞因子的分泌和MMPs 的表達，特別是MMP9 的激活，抑制單核細胞對HSCs 的黏附，且在炎癥階段抑制FGF 信號以抑制HSCs 的活化來減輕纖維化的進展。膠質細胞系來源的神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)，是TGF-β超家族的一員，可通過Ret/ALK5 受體以及AKT(AKT serine/threonine kinase 1) 和Smad(mothers against dpp)通路誘導HSCs 激活，阻斷GDNF 可抑制HSCs 的激活，而抑制纖維化進展[17]。目前多項研究表明過氧化物酶體增殖物激活 受 體(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ)是HSCs激活和表型改變的關鍵介質，可影響HSCs處于靜息期的狀態。Lu等[18]研究發現，大鼠在低氧刺激下引起肝纖維化，HSCs 活化標記物增多，同時伴隨著PPARγ表達的降低，而通過體內外加入PPARγ激動劑可以減少HSCs 活化和膠原沉積，抑制肝纖維化。

3.2 促進細胞外基質降解

肝纖維化的一個重要特征是肝臟結構的破壞和過度的ECM合成和沉積。正常肝臟中ECM的含量非常有限，但其構成了一個復雜的結構支持性蛋白質網絡，在調節組織穩態、重塑和再生中發揮重要作用。ECM成分的交聯，特別是纖維膠原和彈性蛋白，與纖維化進展密切相關。越來越多的證據表明，ECM降解可能參與肝纖維化的自發溶解。

3.2.1 減少膠原產生減少膠原產生是肝纖維化逆轉的重要策略之一。C9復合物[19]可以抑制LARP6(La ribonucleoprotein 6)與編碼I 型膠原的mRNA 結合，從而抑制動物模型中的纖維化發生，還可以減少HSCs的I型膠原分泌。趨化劑受體同源分子[20](prostaglandin D2 receptor 2，CRTH2)是前列腺素D2 的質膜受體，錨定的CRTH2可以與LARP6的膠原mRNA識別序列結合，并促進細胞中膠原mRNA的降解。Fan等[21]研究發現ECM1敲除小鼠可自發發展為肝纖維化，并在第2個月時死亡；而且ECM1可通過與αv整合素相互作用使TGF-β保持在非活化狀態以抑制肝星狀細胞活化和肝纖維化的發生。抑制素家族中的β-抑制素2 隨著肝纖維化的進展而表達增加，小鼠模型和體外實驗均表明降低β-抑制素2 的表達可減少膠原的表達并改善纖維化[22]。也有研究表明，相比于減少膠原的產生，增強金屬蛋白酶的活性，減弱其抑制劑的表達在肝纖維化回歸中更為重要。

3.2.2 增強ECM的降解在纖維形成過程中，I型、III型膠原以及纖維連接蛋白逐漸取代正常肝臟中IV 型、VI 型膠原，這種高度穩定和交聯的ECM分子可以被MMP特異性降解。TIMP可導致基質金屬蛋白酶的催化活性下降，多項研究表明TIMP的持續產生似乎是纖維化進展的關鍵。

早在2003年[23]發現腺病毒介導的MMP1表達可以改善TAA誘導的大鼠肝纖維化，并提出ECM的降解伴隨著aHSCs的抑制和凋亡。在CCl4和膽管結扎誘導的肝硬化大鼠模型中，腺病毒載體介導的MMP-8過表達[24]可以逆轉纖維化，并改善肝功能和肝內血壓，同時降低TGF-β 表達，而MMP-9 和HGF(hepatocyte growth factor)表達升高。MMP-9 突變體[25]可作為TIMP-1拮抗劑以減弱CCl4誘導的纖維化；除此之外，Tsay等[26]提出，抑制肝細胞中miR-221-3p 會導致沉積的細胞外基質的更快溶解；下調miR-221-3p 可誘導肝細胞中GNAI2 的表達，抑制CCl2的分泌，從而導致HSCs活化減少，改善肝纖維化。

3.2.3 改變ECM 的空間構象和基質剛度賴氨酸氧化酶(lysyl oxidase，LOX)和賴氨酸氧化酶樣蛋白2(lysyl oxidase like 2，LOXL2)都在肝纖維化的缺氧環境中表達上調，其賴氨酸殘基可誘導纖維蛋白的共價交聯，增加對ECM降解的抵抗，促進肝纖維化的穩定和積累。近來Klepfish 等[27]提出，使用一種新型抗LOXL2 中和抗體GS3411 能使膠原降解后的空間構建發生變化，使得單核來源的巨噬細胞等分泌的MMPs 更易發揮作用，加速和增強了膠原蛋白的降解，有效緩解肝纖維化和促進纖維化逆轉。在肝臟中，基質剛度的升高可以激活HSCs 或成纖維細胞，進而導致ECM的沉積，形成正反饋回路。所以有研究[28]表明，抑制ROCK(Rho kinase)信號，靶向YAP(Yes1 associated transcriptional regulator)或直接靶向α-SMA的表達等可以降低纖維組裝，減輕肝纖維化。

3.3 免疫細胞及免疫反應是把雙刃劍

在纖維化進展過程中，非實質細胞，如肝間充質細胞，免疫細胞和內皮細胞是纖維化微環境的關鍵細胞組成部分，通過引發炎癥等參與傷口愈合和組織修復，并調節HSCs 轉分化和調節ECM 重塑來促進ECM 的積累。免疫反應在纖維化疾病中起著重要作用，對免疫細胞以及其信號通路的系統研究仍然是開發新療法的基礎。

3.3.1 巨噬細胞具有雙重作用肝臟中含有大量組織駐留的巨噬細胞，稱為庫普弗細胞(KCs)，在生理和病理上可維持肝臟免疫穩態。庫普弗細胞的激活和單核/巨噬細胞的募集是控制纖維化起始、持續和解決的關鍵事件。在損傷的肝臟中，巨噬細胞表型隨炎癥、纖維化的持續時間和程度而動態變化，具有較高的可塑性且具有異質性表型。

肝巨噬細胞具有雙重功能，如新鮮浸潤的Ly-6C+單核細胞來源的巨噬細胞具有促炎表型，加重炎癥。因此，使用抗CCl2或CCR2[29](C-C motif chemokine receptor 2)的拮抗劑可以抑制對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)給藥后早期單核細胞浸潤從而改善肝損傷，發揮抗纖維化作用。在非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)患者[30]中，CCR2/CCR5 雙抑制劑治療可阻止單核細胞來源的巨噬細胞招募和星狀細胞激活，并抑制纖維化。而在最近的兩項Ⅱ期臨床試驗的報告中強調了這一概念，這些報告顯示炎癥信號的特異性抑制劑絲氨酸/蘇氨酸激酶ASK1 抑制劑selonsertib[31]和雙CCR2/CCR5 抑制劑cenicriviroc[32]會靶向NASH和纖維化患者的巨噬細胞。雖然這兩種藥物可能針對巨噬細胞的不同功能，但均具有抗纖維化作用。

然而，一些肝纖維化的小鼠模型顯示，肝巨噬細胞在纖維化的進展和消退過程中具有相反的功能。浸潤單核/巨噬細胞也通過產生抗纖維化介質如MMP12 和MMP13 促進纖維化消退，或吞噬肝細胞碎片誘導Wnt3a(Wnt family member 3A)的表達而有利于實質再生[33]。CD11b(integrin subunit alpha M)雙胎菌毒素受體轉基因小鼠中巨噬細胞的選擇性消耗能夠阻止了慢性損傷后的纖維化發展，但它也能延緩損傷停止后的修復過程[34]。并且巨噬細胞和HSCs雙向調控，活化的HSCs有助于巨噬細胞表型改變為促炎癥和促纖維化，而在HSCs[35]中抑制p38(p38 kinase)可以消除這種巨噬細胞表型的變化，巨噬細胞浸潤的消耗或阻斷會減少星狀細胞的活化和纖維化。所以浸潤的單核/巨噬細胞可以環境依賴的方式具有促纖維化性和抗纖維化性。

3.3.2 其他免疫細胞除此之外，中性粒細胞，適應性T細胞和B 細胞，NKT 細胞等免疫細胞在肝纖維化中同樣起重要作用。中性粒細胞[36]是一種先天免疫細胞，通常會加劇炎癥從而促進纖維化的進展，但也有減輕肝臟炎癥和纖維化的能力，在小鼠肝纖維化模型中通過MMP 的表達產生抗纖維化作用。適應性免疫系統中的T 細胞和B 細胞在慢性損傷的肝臟中都很豐富。B細胞已被鑒定為肝纖維化中的促纖維化細胞成分，可能通過調節HSCs-單核細胞的相互作用來調節早期纖維化[37]。T細胞[38]的貢獻長期以來一直被Th1/Th2理論所解釋，其中Th1和Th2 細胞分別具有抗纖維化和促纖維化作用。NKT 細胞[39]也是肝損傷、修復、炎癥和纖維化過程中免疫反應的中心組成部分，其在纖維化中的功能會受到不同背景的影響。在CCl4誘導的肝纖維化中，NKT缺陷小鼠更易發生肝纖維化；浸潤的NKT細胞增加NKG2D 配體的表達激活HSCs，改善肝纖維化。由此可見，免疫系統中免疫反應所在的微環境和細胞表型在肝纖維化的逆轉中同樣關鍵。

3.4 抑制纖維化相關信號通路

肝纖維化發生發展過程極其復雜，各種炎癥，趨化因子的刺激不僅能夠改變肝臟微環境，也通過不同的信號通路發揮作用。廣泛研究的TGF-β，YAP-TAZ 等通路均與肝纖維化密切相關。

在哺乳動物中，轉化生長因子TGF-β具有TGF-β1、TGFβ2和TGF-β3三種不同亞型，其分布具有細胞類型差異性，能夠調節細胞凋亡、增殖、分化、遷移和侵襲等過程。TGF-β1在健康和慢性損傷的肝臟中被廣泛研究，并在多項臨床研究中作為治療靶點。YAP/TAZ通路在肝纖維化過程中的正調控和負調控存在相互矛盾的數據。Liu等[40]的研究證明了維替泊芬抑制YAP可加劇肝纖維化。最近有研究表明，抑制YAP/TAZ信號可以減弱肝纖維化，如肝細胞特異性YAP 和YAP/TAZ 敲除可以減少纖維生成[41]。

3.5 其他療法

近年來，干細胞移植已成為一種有效的肝病治療方法。鹿角干細胞[42](antler stem cells，ASCs)移植可有效減輕肝纖維化，抑制星狀細胞的活化，減少脂肪變性，增加肝細胞再生，減少炎癥，顯著增強肝功能，并且ASCs 具有易于獲得、增殖能力高和體外擴增的優勢。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可促進肝細胞再生，增強肝功能，逆轉肝纖維化[43]。

在肝細胞和LSECs中，自噬主要作為一種抗氧化和細胞保護機制保持細胞穩態。LC3 相關吞噬作用(LC3-associated phagocytosis，LAP)[44]，是一種非典型的自噬形式，在嚙齒動物 慢性肝損傷期間防止肝臟和全身炎癥，具有抗纖維化作用。自噬[45]的促纖維化作用直接依賴于HSCs活化過程，自噬可以誘導肝纖維化中HSCs 的激活和增殖，而用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)或特異性小干擾RNA(siRNA)阻斷自噬相關基因可減少HSCs激活，減輕纖維化程度。

4 小結及展望

隨著肝臟損傷和纖維化機制研究的深入，目前大家普遍認為肝纖維化處于一個可逆轉期，在這一時期進行干預，肝臟可回歸相對健康的狀態。因此肝纖維化的早期診斷和可逆轉期的有效把握對肝臟疾病的治療非常重要。由于體內很多細胞和分子在不同的肝臟微環境下有雙重作用，所以關于機體微環境，細胞表型和機制的關系的研究，對肝纖維化的靶向治療至關重要。

除此之外，肝損傷和纖維化是一個各因子互相交聯，互相作用的復雜系統。而研究時，往往是從細胞模型或是動物模型入手，而這還不能完全代表人類疾病，并且模型建立比人類疾病要快得多，這肯定會影響細胞對損傷的反應。它們通常只反映了發病機制的某些方面(例如，蛋氨酸膽堿缺乏飲食模型中的嚴重炎癥和纖維化，且缺乏胰島素抵抗、肥胖或心血管共病)，很少納入完整的病因特異性機制。并且有的藥物具有多種靶點，為避免引起非必要性損傷，綜合分析每一種藥物的毒副作用，調整不同的整合方案，將不同優勢治療方案結合是進行肝纖維化逆轉的有效解決手段，例如嵌合抗原受體CART 治療。技術的進步也提供了更多了解纖維化疾病的研究方式，如單細胞RNA測序、空間蛋白質組學、多參數組織學分析或系統生物學方法，深入了解病理機制，將有助于克服困難，為特異性靶點的尋找和有效的肝纖維化治療鋪平道路。