LPS經TLR4通路引起膿毒癥相關的急性腎損傷（SA-AKI）的分子機制研究進展

朱雨杉，周樂汀，王 涼

（南京醫科大學附屬無錫人民醫院腎臟內科，江蘇 無錫 214000）

膿毒癥是宿主感染后引起的全身炎癥反應綜合征，發病后易引起多器官功能障礙，其中腎臟最常累及，可引起膿毒癥相關的急性腎損傷（acute kidney injury，SA-AKI）[1]。SA-AKI已被認定為是膿毒癥的致命并發癥，并且其在膿毒癥患者中表現為較高發病率及死亡率，可達60%～80%[2-4]。在SA-AKI中，革蘭氏陰性菌感染較為普遍。而多數革蘭氏陰性菌致病能力與其細胞壁最外層的成分——脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）相關[5]。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是參與LPS識別和信號啟動的關鍵受體。本篇綜述主要講述LPS通過TLR4通路引起SA-AKI的分子機制，有望從此方向入手研究靶向藥物，對SA-AKI針對性治療，改善患者預后，提高患者生活質量，降低死亡率。

1 LPS組成結構

LPS，又稱內毒素，位于革蘭氏陰性菌外壁最外層，毒性成分主要為脂質A。其可啟動機體炎癥反應，引起大量炎癥因子釋放，從而造成發熱、微循環障礙、內毒素血癥等一系列機體機能紊亂，甚至導致休克和多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），進而危及生命。

LPS是一種經典的病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs），它由脂質A、短核心低聚糖和O抗原多糖三個不同區域組成，其中脂質A結構域是TLR4識別LPS時的主要部分。在不同結構LPS中，有6個脂質鏈的LPS最容易激活TLR4信號。單磷酸基脂質A 較之去掉一個磷酸基，但是其炎癥活性較一般LPS明顯降低，表現出低毒性，但仍具有免疫刺激特性，可用作人類疫苗佐劑[6]。

2 LPS激活TLR4信號通路

LPS首先被LPS結合蛋白（recombinant lipopolysaccharide binding protein，LBP）識別，LBP通過復合物結合的形式把LPS傳遞給白細胞分化抗原CD14。CD14可將LPS聚集物分解成單體分子，并將LPS呈給TLR4-MD2復合物。TLR4-MD2復合物與LPS結合可以引起核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、干擾素調節因子（interferon regulatory factor 3，IRF3）等與TLR4相關的多種信號通路成分的激活，進而產生促炎細胞因子，引起一系列炎癥反應，對機體造成損傷。

2.1 LBP被識別

當LPS進入宿主后，首先被血清中的LBP從細菌外壁和囊泡識別提取，形成LBP-LPS復合物。LBP是一種I型急性期蛋白，可在宿主感染、燒傷、手術、創傷等情況下出現，其可迅速誘發機體以防御為主的非特異性反應。其靈敏度較高，即急性炎癥反應時，LPS濃度較低水平，LBP也會升高[7]。膿毒癥可引發全身炎癥反應，而單獨LBP對組織損傷發展無較大影響，但其作為LPS載體，可反饋細胞及全身對LPS反應調節作用，并且腎臟及肝臟等多個器官部分類型細胞有助于LBP合成，從而將促進局部炎癥擴大，導致患者較易出現長期炎癥狀態，進而擴大膿毒癥對機體危害程度，引起患者發生SA-AKI[5]（見圖1）。

圖1 流程圖

2.2 LBP經CD14傳遞

CD14是一種模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），被認為是TLR4激活位點，有膜結合形式和可溶性形式兩種形式[8]。

LBP通過LBP-LPS復合物形式把LPS傳遞給CD14。CD14可將LPS聚合物轉變為單體分子，使LPS更易被識別[9]。隨后，結合CD14的單個LPS分子以TLR4依賴方式轉移至骨髓分化因子2（myeloid differentiation protein-2，MD2）上。CD14自身不會和LPS結合，也不會直接和LBP結合，只有在LPS存在情況下，CD14才對LBP表現為較高結合親和力。而在LPS轉移后，CD14會立即從LBP-LPS膠束復合物中分離，而LBP在多輪LPS轉移過程中仍會與LPS結合。LPS從CD14轉移到MD2是必需的，而若TLR4缺失，CD14也可將LPS轉移到MD2，但數量有限[10]。

在膿毒癥開始階段，血清可溶性CD14濃度升高，以防止感染擴散[11]。有研究表明，即便在低濃度LPS中，若同時有可溶性CD14和LBP存在，近端小管細胞對LPS激活敏感性能高達100倍；而可溶性CD14和LBP的存在也是誘導管狀細胞凋亡的必要條件[12]。而在膿毒癥發生過程中，腎小管損傷可由AKI進行傳播蔓延，并以腎小管發生急性損傷、腎小管細胞死亡及壞死細胞進入腔內為特征，造成腎小管細胞凋亡后，其胞內線粒體功能發生異常，從而將導致局部微循環障礙及氧化應激，進而可造成SA-AKI，同時因線粒體功能異常，將造成患者腎臟ATP合成異常，進一步惡化患者病癥[13-14]。

2.3 LBP與TLR4-MD2復合物結合

在與LPS結合之前，MD2與TLR4胞外結構域形成穩定的異源二聚體。與LPS結合會引起TLR4-MD2復合物二聚化。MD2比TLR4小，是TLR4-MD2受體復合物的主要LPS結合模塊。它主要通過氫鍵、電荷等親水性相互作用與TLR4結合。參與這種相互作用的殘基突變會阻斷TLR4和 MD2結合以及LPS信號傳導，從而可降低炎癥因子釋放水平，改善患者膿毒癥癥狀，進而避免或降低發生SA-AKI概率[6]。

TLRs是I型跨膜受體，其胞外區域有一個馬蹄形的螺線管結構，負責識別各種微生物分子的共同結構模式。例如，TLR3可識別病毒雙鏈RNAs，TLR4-MD2復合物可識別LPS，TLR5可識別細菌鞭毛蛋白，TLR7或TLR8可識別病毒和細菌單鏈RNAs[15]。TLRs胞內結構域與白細胞介素-1受體（IL-1R）家族具有大量的序列和結構同源性，被命名為Toll/IL-1R同源性（TIR）域[6]。

膿毒癥發生過程中，患者發生全身炎癥反應，主要為LPS與TLR-4相結合后，激活與TLR-4相關信號通路，從而引起趨化性細胞因子及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等量釋放，因TNF-α為觸發全身炎癥反應關鍵因子，可直接誘導多種炎性因子釋放，故其水平在機體內大量升高，將觸發炎癥級聯反應，進而加重炎癥反應，引起全身炎癥反應發生[16]。TAK-242是toll樣受體4介導的信號轉導小分子抑制劑，可選擇性地結合TLR4細胞內區域[17]，而干擾CD14與 TLR-4復合物介導的信號轉導，則可直接抑制LPS與TLR-4結合，從而可避免與TLR-4相關信號通路被激活，故可減緩炎性因子釋放，進而降低機體炎癥反應。在動物模型中，TAK-242可以抑制血清TNF-α、IL-1、IL-6[18]，但是在臨床研究中，TAK-242不能抑制膿毒癥、休克或呼吸衰竭患者的細胞因子水平[19]。

一些具有4個脂質鏈的脂質A衍生物可與TLR4-MD2復合物競爭結合[6]，如脂質IVa和Eritoran（E5564）。脂質IVa是LPS的前體形式，是 MD2配體，可作為人TLR4 -MD2的拮抗劑。E5564是一種合成脂質A拮抗劑，可與LPS競爭性結合TLR4 -MD2復合物。但是在目前臨床研究中，應用E5564并沒有降低SA-AKI患者的死亡率，改善預后[20]。

2.4 LBP激活TLR4下游信號通路

與LPS結合的TLR4形成同源二聚體，并通過受體和配體之間的TIR結構域相互作用，啟動細胞內兩條信號通路：髓樣分化因子88（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）依賴信號通路和TRIF（Toll/IL-1受體結構域接頭分子）依賴信號通路[21]。

在與LPS結合后，TLR4的TIR結構域與MyD88的TIR結構域相互作用，并與另一種含有TIR的接合蛋白（Mal）相互作用。MyD88參與除TLR3外所有TLRs啟動的信號通路。在MyD88依賴通路中，只有那些涉及TLR2和TLR4的通路需要Mal來實現有效信號轉導[6]。MyD88可與白介素-1受體激酶1（interleukin-1 receptor associated kinase-1，IRAK1）及白介素-1受體激酶4（interleukin-1 receptor associated kinase-4，IRAK4）形成復合物，進而激活腫瘤壞死因子受體活化因子6（yumor necrosis factor-associated factor 6，TRAF6），導致下游NF-κB抑制蛋白激酶（ inhibitory nuclear factorkappa B kinase，IKK）復合物、絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和 PI3K/Akt信號通路的激活。IKK的激活引起NF-κB核易位，從而引起炎癥因子的釋放。PI3K（磷脂酰肌醇激酶3）激活Akt，導致p65磷酸化從而激活NF-κB通路。NF-κB是多種炎性因子關鍵轉錄調控因子，在膿毒癥過程中，其被激活可引起炎性級聯反應。MAPK通路主要是JNK（c-Jun N端激酶）激活AP-1（激活因子l）引起炎癥因子的釋放。在TRIF依賴的信號通路中，TRIF相關的接頭分子（TRAM）識別TLR4的TIR結構域，引起干擾素調控因子3（interferonregulatory factor 3，IRF-3）磷酸化，磷酸化的IRF-3轉移到細胞核內啟動干擾素（interferon，IFN）基因的轉錄，進一步促進炎癥反應[6，22]。多種炎性介質被釋放，發生炎癥級聯反應，則會加重炎性反應，從而易引起機體發生全身炎癥反應綜合征，其正是膿毒癥主要特征，同時炎癥級聯反應可將炎性反應信號逐步放大，從而引起機體細胞生理功能紊亂，進而造成患者腎臟功能急性衰退，引發SA-AKI。

3 TLR4下游靶點及相關信號通路

除TLR4識別LPS過程中存在可考慮的靶點，其下游信號應答也有些靶點需要注意。

3.1 核轉錄因子 κB（NF-κB）

NF-κB為多種炎性因子的關鍵轉錄因子，能誘導 TNF-α、IL-1、IL-6和 IL-8的合成和釋放[23]。動物實驗證明直接抑制NF-κB可以降低炎癥因子水平[24]。在大鼠原代近端小管上皮細胞上，NF-κB在LPS誘導的單核細胞趨化蛋白-1 （monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）轉錄中起關鍵作用，激活蛋白（activator protein 1，AP-1）和序列特異性轉錄因子（transcription factor Sp1，Sp1）在MCP-1的基礎表達中起關鍵作用。關于TLR4/NF-κB信號通路，在膿毒癥過程中，LPS經感染部位或遠端損傷部位通過腎小管濾過等作用進入腎小管，隨后引起腎臟廣泛表達TLR4，并識別LPS，從而激活NF-κB，同時有研究表明NF-κB可誘導多種炎性因子轉錄，從而觸發炎性級聯反應，造成腎臟炎癥環境[25]。NF-κB是經內質網（endoplasmic reticulum，ER）的信號途徑被激活，其中包括PKR樣ER應激激酶、活化轉錄因子6及肌醇需求酶1等應激信號通路，而該三種應激信號通路均參與包含膿毒癥在內的多種疾病[26]。此外，ER具備蛋白質合成等作用，當機體受到感染等有害刺激時，則會造成ER應激反應，即ER管腔紊亂，而改善機體ER應激則有利于抑制機體早期炎癥反應，從而改善SA-AKI預后[25]。但腎臟中炎性細胞因子的水平更可能是受到全身炎癥反應，而不是局部反應的影響[27]。因此降低全身的NF-κB相對來說更為重要。另有研究表明增加三結構域蛋白27（tripartite motif 27，TRIM27）的表達可以顯著抑制TLR4/NF-κB信號通路的活性，從而發揮抗炎和抗凋亡作用，能有效緩解LPS誘導的HK-2細胞損傷和小鼠AKI[28]。

3.2 堿性磷酸酶（ALP）

外源性ALP最初用于治療膿毒癥不合并AKI的患者，但在膿毒癥動物模型研究中，ALP可通過TLR4通路減弱先天免疫反應，其優勢有二，一是明顯降低炎癥因子水平，其中TNF-α的釋放可降低98%，這意味著預期治療效果較好；二是耐受量大，意味著治療區間大[29]。但有研究表明對于膿毒癥相關急性腎損傷，應用ALP后血漿肌酐短期內降低，AKI生物標志物水平在短期內得到改善，但未改善尿量減少問題。總的來說，ALP有一定的保護作用，但治療效果并未達到預期效果[30]。

3.3 轉化生長因子-β（TGF-β）與內皮—間充質轉化（EndMT）

TGF-β可誘導EndMT[31]。EndMT可促進腎成纖維細胞出現，從而促進腎纖維化，引起慢性腎功能不全[32]。暴露于LPS的內皮細胞與TGF-β處理的內皮細胞發生相同表型變化，提示LPS在誘導EndMT中存有潛在作用[33]。此外，腎周細胞為管周毛細血管內的常駐基質細胞，可穩定內皮細胞，且其與膿毒癥相關血管不穩定劑滲漏中發揮關鍵作用，而膿毒癥過程中，將破壞腎周細胞與內皮細胞之間的相互作用，從而造成微血管呈高通透性[34]。雖腎周細胞無特異性標志物，但普遍認為絡氨酸激酶為其分離的標志物，且有研究表明，當腎周細胞損傷后，絡氨酸激酶將從內皮分離，從而促進腎纖維化[5]。腎纖維化為組織修復常見過程，但在膿毒癥過程中，大量且持續性炎癥反應將造成SA-AKI。

3.4 腫瘤壞死因子受體1（TNFR-1）與Caspase

研究表明TNFR-1基因敲除小鼠對LPS誘導膿毒癥性AKI具有耐藥性，與正常組相比，小鼠腎細胞凋亡、中性粒細胞浸潤均較少，提示TNFR-1在膿毒性AKI壞死和凋亡中起到直接作用。在TNFR-1下游，HK-2細胞凋亡可能部分依賴于Fas和Caspase表達。膿毒癥AKI患者血液中Fas、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9水平均顯著升高，通過樹脂吸附可下調上述炎癥物質介導信號通路的激活，從而達到減少細胞凋亡及抑制炎癥來保護腎臟效果[35-36]。

TNFR-1/Caspase通路為促炎反應重要信號通道，有研究表明，外周血單個核細胞（NLRP3）可激活此通道，故抑制NLRP3的激活，可對炎性反應靶點進行有效抑制[37]。TNFR-1與TNF-α相關，而TNF-α為一種促炎因子，其可促進多種免疫因子表達，有研究表明其在炎癥反應中產生最快，且達峰時間最早，是促進全身反應綜合征的重要因素[38]。Caspase為細胞凋亡必要效應蛋白酶，當TNFR-1被激活產生炎癥因子時，其可通過作用于細胞凋亡及炎癥通路，從而參與細胞凋亡小體形成過程，造成腎臟細胞自噬及凋亡加劇，進而引起腎損傷程度加深[39]。

3.5 其他

TLR4/MyD88信號通路是多種炎性反應所經途徑。高遷移率蛋白B1為一種促炎因子，當細胞發生損傷，其將被釋放到細胞外，從而識別TLR4受體并結合MyD88傳遞相關信息，以參與機體炎癥反應及細胞凋亡[40]。此外，IL-33基因修飾的骨髓間充質干細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）可顯著改善膿毒癥AKI大鼠的腎功能，其機制可能與IL-33調控TLR4/MyD88信號通路、抑制腎臟炎癥反應有關[41]。SA-AKI小鼠腎白介素-10表達增加，調節性T細胞增殖增加，同時存在大量免疫細胞凋亡，阻斷白細胞介素-10可挽減少膿毒癥小鼠急性腎損傷[42]。

4 小結

目前SA-AKI的防治以應用抗生素、控制感染、液體治療及腎臟替代治療等對癥支持治療為主[2]，效果有限，尚缺乏靶向治療藥物。對于靶向藥物研究，TLR4識別LPS階段看似更具對腎臟保護作用，但是目前該類相關藥物在臨床上未能出現明顯治療作用，有效靶向治療藥物有待進一步研發；對于TLR4通路下游信號研究較多，但是機制尚不清楚，TLR4/NF-κB通路方面研究最多，有些已經面市藥物也被證明具備通過TLR4/NF-κB通路抑制炎癥的作用，但具體療效有待進一步探尋。