羧甲司坦緩釋片的含量測定及體外釋放度研究

鐘曉嬌 劉麗娜 王磊 肖婷婷 黃靜

(貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550025)

羧甲司坦是一種黏液調節劑，具有明顯抗炎、抑制氧化反應等作用[1]，目前廣泛用于改善呼吸系統疾病[2]。由于羧甲司坦半衰期短，當前市售劑型均需一天多次給藥，極大地降低了患者的順應性和依從性，尤其是老年患者[3]。將羧甲司坦制成緩釋劑型，不僅能減少患者服藥次數，提高病患順從性，同時也能使其在體內緩慢平穩的釋放藥物，避免出現峰谷現象，降低毒副作用，提高臨床用藥的安全性。本課題在前期研究基礎上以羧甲司坦緩釋片作為研究對象，采用UV測定其吸光度值，對其精密度、穩定性、專屬性等進行考察；在含量測定方法建立的基礎上對釋放度測定方法進行選擇，考察釋放介質及pH、取樣時間點及釋放度，為羧甲司坦緩釋片的處方篩選提供實驗依據，并與市售羧甲司坦普通片的釋放百分率比較，為羧甲司坦新制劑的研制提供參考。

1 儀器與材料

1.1實驗儀器 UV-2700紫外可見分光光度計(島津儀器(蘇州)有限公司)，ZRS-8G 釋放度試驗儀(天津盛達三合光學儀器有限公司)，TD6 低速離心機(上海盧湘儀離心機有限公司)

1.2試藥 羧甲司坦標準物質(批號：100246-201503，廠家：中國食品藥品研究院)，羧甲司坦片(批號：161202，廠家：廣東南國藥業有限公司)，磷酸氫二鉀(批號：20200322，廠家：廣東·汕頭市西隴化工廠)，磷酸二氫鈉(批號：20200616，廠家：國藥集團化學試劑有限公司)

1.3方法

1.3.1溶液配制 (1)pH=5.8磷酸鹽緩沖液配制：稱取磷酸二氫鉀8.34 g與磷酸氫二鉀0.87 g，加蒸餾水使混合溶解成1000 mL，即得。(2)人工胃液的配制：量取稀鹽酸16.4 mL，加蒸餾水約800 mL與胃蛋白酶10 g，充分搖勻后，加蒸餾水稀釋成1000 mL，即得。(3)pH=6.6磷酸鹽緩沖溶液配制：分別稱取磷酸二氫鈉1.74 g，磷酸氫二鈉2.70 g，氯化鈉1.70 g，加蒸餾水至400 mL，溶解混勻即得。(4)pH=7.8磷酸鹽緩沖溶液配制：取磷酸二氫鈉2.76 g，加水溶解，并用蒸餾水稀釋至100 mL，配成甲液。取磷酸氫二鈉35.90 g，加水溶解，并用蒸餾水稀釋至500 mL，配成乙液。取上述甲液17 mL與乙液183 mL混合，搖勻，即得。(5)對照品溶液的配制：精密稱定羧甲司坦對照品10 mg，放入50 mL容量瓶中，加適量pH=6.6的磷酸鹽緩沖液溶解，用磷酸鹽緩沖溶液定容至刻度線，制得每1 mL中約含200 μg的溶液，即得。(6)空白溶液的配制：按處方比例精密稱定各輔料適量，混勻，置250 mL容量瓶中，加緩沖液定容至刻度，超聲10 min，以5 000 r/min的轉速離心10 min，離心兩次。取5 mL超聲后的溶液置于50 mL容量瓶中，加緩沖液稀釋至刻度。即得。(7)供試品溶液的制備：取自制羧甲司坦緩釋片10片，研成細粉，取細粉適量。放入250 mL容量瓶中，加入pH=6.6的磷酸鹽緩沖液定容至刻度，超聲10 min，在5000 r/min，10 min的條件下離心，離心兩次。取5 mL超聲后的溶液置于50 mL容量瓶中，加入磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度線制成每1 mL中約含200 μg的溶液。(8)2.0%茚三酮溶液配制：稱取茚三酮2.00 g于100 mL量瓶，加適量乙醇溶解，定容，混勻即得。

1.3.2檢測波長的測定 取供試品溶液、輔料溶液、對照品溶液各1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加pH=6.6的磷酸鹽緩沖溶液1 mL，充分搖勻，水浴加熱15 min，迅速冷卻，蒸餾水定容至刻度線，以溶劑做空白對照[4]，在400～800 nm間掃描。

1.3.3標準曲線的制備 精密量取200 μg/mL的對照品儲備液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加最終確定的釋放介質1.8 mL，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加最終確定的釋放介質1 mL，水浴加熱15 min后，取出用冰水浴迅速冷卻，蒸餾水定容至刻度線，以溶劑作空白對照，按UV在最大吸收波長處測定吸光度值。

1.3.4羧甲司坦緩釋片含量的測定 分別取三批取羧甲司坦緩釋片各10片，研細，精密稱取0.5 g，置于250 mL容量瓶中，加入適量甲醇，加入pH=6.6磷酸鹽緩沖液定容至刻度，超聲20 min，以5 000 r/min離心10 min后，取5 mL溶液至50 mL容量瓶中，加pH=6.6緩沖液定容，取1 mL溶液至25 mL容量瓶中，加1 mL 2%茚三酮，加pH=6.6緩沖液1 mL，水浴加熱15 min,迅速冷卻，蒸餾水定容，在最大吸收波長處測定吸光度值。利用回歸方程計算各樣品的羧甲司坦含量。

1.3.5精密度實驗 分別精密吸取羧甲司坦對照品溶液稀釋成1.6、8.0和14.4 μg/mL的低、中、高濃度溶液各6份，加入2.0%茚三酮溶液0.4 mL，加入最終確定的釋放介質1 mL，搖勻，水浴加熱15 min，迅速冷卻，蒸餾水定容，利用UV在最大吸收波長處測定吸光度值，其中日內精密度每隔2 h重復1次，連續測量6次，日間精密度每隔24 h測量1次，連續測3次，計算RSD值。

1.3.6穩定性實驗 精密吸取羧甲司坦對照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最終確定的釋放介質1 mL，水浴加熱15 min，迅速冷卻，加蒸餾水稀釋至刻度線，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h，12 h時利用UV在最大吸收波長處測定吸光度值，并計算RSD。

1.3.7重復性實驗 精密吸取羧甲司坦對照品溶液6份，每份1 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最終確定的釋放介質1 mL，搖勻，水浴加熱15 min，迅速冷卻，蒸餾水定容，利用UV在最大吸收波長處測定吸光度值，計算RSD值。

1.3.8回收率實驗 精密稱取羧甲司坦緩釋片釋放限度的30%、60%和100%的羧甲司坦對照品各3份，置50 mL量瓶中，分別加入處方比例的空白輔料[5]，各精密量取1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最終確定的釋放介質1 mL，熱水浴加熱15 min，迅速冷卻，用蒸餾水定容，利用UV在最大吸收波長處測定吸光度值，計算RSD。

1.4羧甲司坦緩釋片釋放度測定

1.4.1釋放方法的選擇 取羧甲司坦緩釋片分別按釋放度測定方法槳法和籃法操作，以最終確定的釋放介質900 mL為釋放介質，轉速100 r/min，分別在最終確定的取樣時間點時取樣4 mL[6]，離心，取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最終確定的釋放介質1 mL，充分搖勻，水浴加熱15 min，迅速冷卻，用蒸餾水定容至刻度線，利用UV在最大吸收波長處測定吸光度值。

1.4.2釋放介質的選擇 分別以pH=5.8、pH=6.6、pH=7.8的磷酸鹽緩沖溶液、人工胃液作為釋放介質的選擇，按照最終確定的釋放度法，轉速為100 r/min，分別在最終確定的取樣時間點取樣4 mL，離心，取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，各對應的釋放介質1 mL，充分搖勻，熱水浴加熱15 min，迅速冷卻，用蒸餾水定容，利用UV在最大吸收波長處測定吸光度值。

1.4.3時間點的選擇 緩釋制劑至少取3個取樣時間點，第一點在0.5～2 h，用于考察藥物是否存在突釋(釋放量小于30%)；第二個取樣時間點為中間取樣時間點，藥物釋放約50%，用于確定釋藥特性；最后一個取樣時間點在藥物釋放約80%取樣，用于考察釋藥是否基本完全[7]。本課題擬采用時間點1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h。將羧甲司坦緩釋片放入溶出杯中，轉速為100 r/min，分別于1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時取樣4 mL，離心，取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最終確定的釋放介質1 mL，充分搖勻，熱水浴加熱15 min，迅速冷卻，蒸餾水定容，利用UV在最大吸收波長處測定吸光度值。

1.4.4羧甲司坦緩釋片釋放度測定 按《中國藥典》2020年版收載的第二法釋放度測定方法槳法：以pH=6.6的磷酸鹽緩沖溶液900 mL為釋放介質，轉速100 r/min，取羧甲司坦緩釋片及市售羧甲司坦普通片4 mL，離心，取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最終確定的釋放介質1 mL，充分搖勻，熱水浴加熱15 min，迅速冷卻，蒸餾水定容至刻度線，利用UV在最大吸收波長567 nm處測定吸光度值，繪制緩釋片和普通片的釋放百分比-時間曲線圖。

2 結 果

2.1檢測波長的測定結果 羧甲司坦在567 nm處存在最大吸收，而溶劑和輔料在567 nm處無明顯吸收，所以本實驗測定羧甲司坦的檢測波長為567 nm，見圖1。

2.2標準曲線的制備結果 以吸光度值A為橫坐標，以羧甲司坦濃度(μg/mL)為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程A=0.0695c-0.0898，相關系數r=0.9993，線性范圍：1.6～14.4 μg/mL，羧甲司坦濃度在此線性范圍內與吸光度值呈良好的線性關系，結果如圖2。

2.3羧甲司坦緩釋片含量測定結果 三批自制羧甲司坦緩釋片的含量測定結果顯示，不同批次羧甲司坦緩釋片含量均在98%以上，表明羧甲司坦緩釋片的含量符合要求，所建立的羧甲司坦緩釋片的含量測定方法可靠。見表1。

表1 羧甲司坦緩釋片含量的測定結果

2.4精密度實驗結果 羧甲司坦溶液高中低濃度的平均吸光度值分別為0.028 μg/mL，0.466 μg/mL，0.921 μg/mL，RSD分別為1.87%，0.81%，0.74%，表明日內精密度良好。見表2。羧甲司坦溶液高中低濃度的平均吸光度值分別為0.027 μg/mL，0.465 μg/mL，0.920 μg/mL，RSD分別為2.0%，0.45%，0.17%，表明日間精密度良好。見表3。

表2 羧甲司坦緩釋片日內精密度實驗吸光度測定(μg/mL)

表3 羧甲司坦緩釋片日間精密度實驗吸光度測定(μg/mL)

2.5穩定性實驗結果 羧甲司坦溶液的吸光度值的平均值為0.464，RSD值為0.42%，表明羧甲司坦樣品溶液在放置12 h內測定，具有較好的穩定性。見表4。

表4 羧甲司坦穩定性實驗結果(n=6)

2.6重復性實驗結果 羧甲司坦溶液的吸光度值的平均值為0.465，RSD值為0.35%，表明該檢測方法的重復性良好。見表5。

表5 羧甲司坦重復性實驗結果(n=6)

2.7回收率實驗結果 平均回收率為99.05%，RSD為1.8%，說明該方法測定羧甲司坦緩釋片釋放度的回收率良好，結果準確。見表6。

表6 羧甲司坦回收率實驗結果(n=9)

2.8羧甲司坦緩釋片釋放度測定結果

2.8.1釋放方法選擇的結果 由圖3結果可知，用籃法作為釋放方法時，釋放較緩慢，可能因羧甲司坦緩釋片粘性較高，容易堵塞轉籃的孔造成釋放緩慢，而槳法釋放速度相對轉籃法快，而且釋放速度相對穩定，因此選擇用槳法作為測定羧甲司坦緩釋片的釋放方法。

2.8.2釋放介質的選擇結果 由圖4結果可知人工胃液作為羧甲司坦釋放介質時，吸光度值幾乎為0，表明羧甲司坦在人工胃液中幾乎不釋放，而用磷酸鹽緩沖溶液作為釋放介質時吸光度值變化較大，說明羧甲司坦在磷酸鹽緩沖溶液中釋放，根據結果可知，當磷酸鹽緩沖溶液pH=5.8和7.8時，吸光度值偏低，釋放緩慢，當磷酸鹽緩沖溶液的pH=6.6時，吸光度值較正常，符合藥典要求，因此選擇pH=6.6的磷酸鹽緩沖溶液作為釋放介質。

2.8.3時間點的選擇結果 由表7結果可知，由于緩釋制劑至少取3個取樣時間點，第一點是開始0.5～2 h的取樣時間點，第一個取樣時間點定為1 h，第二個為2 h；中間取樣時間點為4 h，用于確定釋放是否完全的時間點是8 h，而4～8 h之間的吸光度值相差較大，所以中間加一個取樣時間點6 h。由于10 h和12 h的釋放百分比接近，因此10 h這個取樣時間點舍去，最后一個取樣時間點為12 h，此時藥物釋放接近100%。

表7 時間點的選擇結果

2.8.4羧甲司坦緩釋片釋放度測定結果 利用UV在最大吸收波長567 nm處測定吸光度值。繪制緩釋片和普通片的釋放百分比-時間曲線圖，見圖5。與上市普通片相比，自制羧甲司坦緩釋片體外緩釋效果明顯，推測緩釋片可能延長羧甲司坦在體內的釋放時間，減少用藥次數，提高其生物利用度。同時，也表明試驗制備的羧甲司坦緩釋片體外釋放特征良好，符合緩釋片制備的有關要求。

用一級方程、Higuchi方程及零級方程對自制羧甲司坦緩釋片的釋放結果進行擬合結果，如表8所示。結果表明羧甲司坦緩釋片的釋放結果與一級方程方程擬合性最好，擬合方程為：ln(1-Mt/M∞)=-0.3102t+0.3082，相關系數r=0.9901。

表8 羧甲司坦緩釋片的釋藥方程擬合結果

3 討 論

緩釋制劑的釋藥機制與其所用的緩釋材料具有密切關系，其釋藥過程是緩釋材料、水和藥物等多重因素相互作用的結果。溶解度大的藥物，釋藥機制主要表現為擴散；溶解度小的藥物，釋藥機制主要表現為凝膠層的溶蝕，因此藥物在水中的溶解性影響骨架片的釋藥過程[8]。

在釋放度實驗中，羧甲司坦緩釋片相較于市售普通片，羧甲司坦緩釋片可延緩釋藥速度，從而延長釋藥時間。其中，在釋藥前2 h時，羧甲司坦普通片的釋藥百分率已經達到95%以上，而羧甲司坦緩釋片的釋藥百分率僅接近30%。羧甲司坦緩釋片直到12 h 時釋放百分比才到95%以上，說明釋藥時間明顯延長，達到了緩釋制劑的要求，且在這個釋藥過程中沒有出現“突釋”現象，達到藥物緩慢釋放的目的。

研究緩控釋制劑藥物釋放機制時，通常采用數學模型對藥物釋放曲線進行擬合，然后根據擬合結果對釋藥機制進行推斷[9]。一般可用零級方程、一級方程及Higuchi方程等擬合[10]，擬合時以相關系數r最大者為最佳擬合結果。由結果可知，一級方程的相關系數r最大(r=0.9901)，故自制羧甲司坦緩釋片在釋放介質中的釋放機制接近一級釋藥模型。而零級方程的擬合相關性較差(r=0.9584)，說明該制劑釋藥方式不是單純的擴散機制，可能為擴散與骨架溶蝕相協同的釋藥機制。

本課題建立的羧甲司坦緩釋片的釋放度測定及含量測定方法操作簡單，方便，穩定，可靠，重現性好，可用于羧甲司坦緩釋片釋放度測定，自制羧甲司坦緩釋片釋放速度明顯低于市售羧甲司坦片，其研發和生產成本較低，適合工業化生產，體外緩釋效果明顯，具有較大的臨床應用價值，但其體內外相關性仍需進一步研究。