基于石墨烯固相萃取-毛細管電泳聯用的奶嘴中痕量雙酚A檢測

楊鈺婷，王 永，周柚廷，陳楊潔，梁 立，李惠茗，劉坤平

(1. 成都大學藥學院 藥食同源植物資源開發四川省高校重點實驗室，四川 成都 610106;2. 成都大學食品與生物工程學院，四川 成都 610106)

0 引 言

雙酚 A（bisphenol A，BPA），學名 2，2-二 (4-羥基苯基)丙烷，白色晶體，熔點156～158 ℃，是世界上使用最廣泛的工業化合物之一。它的下游產品包括了PC、環氧樹脂、聚砜樹脂等多聚物材料，廣泛用于日常所能接觸到的塑料制品之中，如食品的外包裝、PVC 管、食品盤、醫用工具等[1]。BPA易水解，可從食品罐、飲料瓶和嬰兒奶瓶、奶嘴等制品中釋放，并通過食物進入人體并且富集。BPA作為一種典型的環境內分泌干擾物，長期接觸BPA的人群易患肥胖癥、糖尿病以及內分泌失調等疾病。幼兒期是體格發育的關鍵期，對BPA暴露的潛在風險更為易感，可能影響兒童體格發育，歐盟認為含雙酚A奶瓶、奶嘴會誘發性早熟[2-4]。因此，建立快速、靈敏的奶嘴中雙酚A的檢測方法具有重要意義。目前，對低濃度雙酚A的測定方法主要有氣相色譜-質譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜法、電化學法及熒光法等[5-8]。但這些方法存在著儀器昂貴、操作繁瑣、檢測靈敏度低等缺點，無法滿足日益增長的BPA檢測的需求。

嬰兒奶嘴中雙酚A含量較低，無法直接進行檢測，需進行前處理富集。固相萃取（SPE）是近年來發展起來的一種理想的樣品前處理技術，可提高樣品富集倍數并減小干擾。目前常用于SPE的吸附劑有C-18、氧化鋁、大孔樹脂及納米材料等。隨著納米技術的高速發展，多種新型的納米材料已被用做SPE小柱的吸附劑，如碳納米管、納米石墨等[9-11]。石墨烯是2004年發現的新型二維納米材料，具有高比表面積（高達2 630 m2/g），高導電性（室溫下載流子遷移率高達15 000 cm2/(V·s)）等優異性質，已應用于各種研究領域[12-14]。其較高的比表面積和大π共軛體系的強吸附作用，使其成為SPE吸附劑的有力候選材料。此外，毛細管電泳（CE）是一種迅速發展的新型液相分離檢測技術，它以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離的電泳分離分析方法。相比于HPLC，CE具有柱效高、分離速度快、溶劑和樣品消耗量少、選擇性強、儀器操作成本低、擁有多種分離模式等優點，在醫學、材料學、環保和食品等領域得廣泛的應用[15]。

本文首先制備高比表面積的石墨烯納米材料，然后將其用做固相萃取吸附劑制備石墨烯基SPE小柱。利用所制備的石墨烯基SPE小柱對BPA的高效富集作用并結合CE技術的高效檢測能力構建了SPE-CE聯用分析方法用于嬰兒奶嘴樣品中BPA的高靈敏快速檢測（見圖1）。為食品接觸材料中痕量組分的分析檢測提供了可行的思路。

圖1 實驗原理圖

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

雙酚 A（BPA），丙酮，水合肼（99%），氫氧化鈉，乙醇，乙醚，硼砂，十二烷基硫酸鈉（SDS）均為分析純，購自成都長征試劑公司。甲醇，乙腈購自百靈威試劑公司。固相萃取小柱空柱管，上下篩板（CNW）和商品化固相萃取小柱（SupercleanTMLC-18 SPE Tubes（500 mg））購自 Sigma-Aldrich 公司。毛細管電泳測試在P/ACE MDQ（Beckman）上進行。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）在Specturm 2（PE）上測試。紫外-可見光譜（UV-Vis）在 UV-2 600 (尤尼柯)上進行。場發射掃描電子顯微鏡（SEM）在JSM-6 701（Kevex）上進行。透射電子顯微鏡（TEM）在G2-F20-STWIN（PEI）上測試。實驗用超純水均取自MilliQ純水系統。

BPA儲備液制備：精密稱取0.1 g BPA，將其置于100 mL容量瓶中，加入適量甲醇，振搖使BPA溶解，最后用甲醇定容，即得1.0 mg/mL BPA儲備液，4 ℃保存備用。

CE運行緩沖液配制：用電子天平稱取硼砂0.436 9 g，十二烷基硫酸鈉（SDS）0.432 6 g，將兩者加入100 mL容量瓶中，加入適量純化水，超聲使其完全溶解。再加入4.0 mL乙腈，最后用純水定容，即得15.0 mmol/L硼砂-十二烷基硫酸鈉-乙腈緩沖液（pH 9.0），4 ℃ 保存備用。

1.2 石墨烯的制備

三頸瓶中加入50 mL蒸餾水及45 mL氧化石墨烯（EGO）分散液（0.5 mg/mL），超聲使之均勻分散。再加入0.5 mL水合肼，攪拌下逐步升溫至95 ℃左右反應24 h。降至室溫后將反應液于15 000 r/min轉速下離心，棄去上清液。下層固體經3遍蒸餾水離心洗滌至中性，烘干備用。

1.3 石墨烯基SPE小柱的制備

準確稱取30.0 mg所制備的石墨烯于研缽中研成粉末，然后轉移至50 mL燒杯中，加入30 mL無水乙醇于超聲波中超聲10 min使石墨烯粉末均勻分散。然后將該分散液逐步引流加入已放置下篩板的3.0 mL干凈的空固相萃取小柱柱管內。待乙醇流出后加上上篩板，完成SPE小柱的制備。

1.4 SPE萃取過程

固相萃取之前，將制備的石墨烯基SPE小柱依次用10.0 mL甲醇和10 mL蒸餾水對其進行活化以去除可能存在的雜質。然后在真空泵的抽力下，使50.0 mL含BPA的樣品溶液以2.0 mL/min的流速流過SPE小柱。用10.0 mL甲醇對吸附富集在SPE小柱內的BPA進行洗脫并收集洗脫液。將洗脫液置于75 ℃水浴中蒸干溶劑，最后以CE運行緩沖液定容至1.0 mL以供毛細管電泳測定之用。作為對比，商品化的SupercleanTMLC-18 SPE 小柱（500 mg）采用同樣的方式對BPA進行富集并進行CE檢測。

1.5 CE測定條件

CE測試采用經活化后的長度為50 cm（有效長度41 cm），內徑50 μm的熔融石英毛細管，運行緩沖液為硼砂-十二烷基硫酸鈉-乙腈緩沖液（pH 9.0），CE運行溫度為25 ℃，運行電壓為25 kV，PDA檢測器檢測波長278 nm，進樣方式為0.5 psi（1 psi=6.895 kPa）壓力下的氣壓進樣，進樣時間5 s。整個CE測試過程按如表1所示的運行流程進行。

表1 CE測試運行流程

2 結果與討論

2.1 石墨烯表征

首先對所制備的石墨烯進行表征以確定石墨烯的成功制備。如圖2（a）的UV-Vis光譜圖所示，氧化石墨烯在230 nm和300 nm處顯示出兩個吸收帶，分別對應于氧化石墨烯的骨架吸收和C=O雙鍵的R吸收帶。經水合肼還原后，石墨烯僅顯示出一個270 nm 的吸收帶，其對應于石墨烯的π-π共軛體系，表明石墨烯的大π共軛體系的恢復。300 nm處氧化石墨烯R吸收帶的消失表明石墨烯表面含氧官能團的去除。此外，如圖2（b）的FT-IR光譜圖所示，氧化石墨烯在1 620 cm–1處表現出C=C雙鍵的骨架振動吸收。由于氧化石墨烯表面含有豐富的C=O，C-O，C-O-C，-OH等含氧官能團，其還表現出3 400 cm–1（-OH），1 730 cm–1（C=O），1 220 cm–1（CO-C）和 1 050 cm–1（C-O）等含氧官能團的吸收峰。經水合肼還原后，石墨烯上 1 730 cm–1，1 220 cm–1和1 050 cm–1等處的吸收峰的消失或減弱表明石墨烯表面的大部分含氧官能團已被清除，表明氧化石墨烯已被成功還原為石墨烯。由圖2（c）的SEM圖可以看出，所制備的石墨烯表現為輕紗狀半透明的層狀結構。由圖2（d）的TEM圖可以看出，石墨烯為形狀不規則的片狀結構，其尺寸范圍為1～12 μm。

圖2 氧化石墨烯與石墨烯的表征結果

2.2 SPE萃取條件優化

在SPE固相萃取中，萃取條件的優化決定著萃取效率及最終的檢測靈敏度。研究對洗脫劑種類、pH、洗脫液體積以及NaCl濃度條件進行了優化，結果如圖3所示。由圖可以看出，甲醇的洗脫能力最強，BPA的回收率達103%，因此，選擇甲醇為最佳的洗脫溶劑。此外，分別選擇pH 9.0，10 mL的甲醇洗脫液體積和60 mmol/L的NaCl鹽濃度為最優的洗脫參數。

圖3 SPE萃取條件優化（洗脫劑種類、pH、洗脫液體積、NaCl濃度）

2.3 CE條件的優化

為確定CE檢測中PDA檢測器的檢測波長，對BPA進行UV-Vis全掃描，得到如圖4插圖所示的UV-Vis圖。可以看出，BPA在278 nm處表現出最大吸收峰，因此選擇278 nm為PDA檢測器的檢測波長。在此波長下對BPA檢測得到如圖4所示的CE圖，可以看出BPA的保留時間為10.20 min，表現出良好的對稱峰形。

圖4 BPA的CE圖（插圖：BPA的UV-Vis）

為使CE測試達到最優的柱效和分離度，分別對CE測試電壓和CE運行緩沖液進行了優化。由圖5（a）可以看出，隨著CE測試電壓的逐漸增大（20，25，30 kV），BPA 的保留時間逐漸減小，均可在20 min內完成測試。但20 kV和30 kV時（曲線c和a），BPA峰的對稱性較差，20 kV時甚至出現了嚴重的拖尾現象。而對于25 kV時，BPA展現出良好的對稱峰形，且基線更加平穩。因此，選擇25 kV為最優的CE測試電壓。由圖5（b）可以看出，單獨使用硼砂緩沖液（曲線a）時，BPA的保留時間為4.92 min，出峰時間太早不利于BPA與雜質組分的完全分離。單獨使用SDS緩沖液（曲線c）時，BPA的保留時間為13.12 min，雖然能保證BPA主峰和雜質組分的完全分離，但出現了前拖現象，而且基線也出現了漂移。使用硼砂和SDS組合緩沖液（曲線b）時，BPA在10.20 min處展現出良好對稱性的峰，既能保證BPA主峰和雜質組分的完全分離，又具有平穩的基線。為保證樣品完全溶解，在緩沖液中還加入少量的乙腈增加溶解性。因此，選擇15 mmol/L 硼砂+15 mmol/L SDS 緩沖液（pH 9.0）為最優的CE運行緩沖液。

圖5 CE測試電壓與運行緩沖液條件優化

2.4 SPE小柱分析性能

在最優的SPE萃取條件下用所制備的石墨烯小柱分別對不同質量濃度（0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 μg/mL） 的 50 mL BPA標準溶液進行萃取富集并加熱濃縮，最后用CE運行緩沖液定容到1 mL后進行CE測試。所得的CE色譜圖如圖6(a)所示，所得標準曲如圖6(b)曲線a所示。作為對比，商品化的SupercleanTMLC-18 SPE 小柱（500 mg）富集后檢測和CE直接檢測的線性關系如圖6(b)曲線b和曲線c所示。三種方法的線性關系分別為：

圖6 不同濃度BPA經石墨烯基SPE小柱富集后CE檢測圖與BPA檢測線性關系圖

曲線a：ABPA=9 955.17CBPA+16 371.84 （r2=0.992 1），線性范圍：0.05～80 μg/mL，檢出限為0.02 μg/mL (S/N=3σ)；

曲線b：ABPA=5 059.32CBPA+5 580.18（r2=0.998 0），線性范圍：0.50～80 μg/mL，檢出限為 0.23 μg/mL(S/N=3σ)；

曲線c：ABPA=496.63CBPA+658.50（r2=0.998 9），線性范圍：4.10～80 μg/mL，檢出限為 3.27 μg/mL(S/N=3σ)。

檢測結果表明，相比于商品化的SPE小柱，所制備的石墨烯基SPE小柱具有更寬的線性范圍和更低的檢出限。同時，由于所制備的石墨烯基SPE小柱的裝柱量為30 mg，遠低于商品化SPE小柱的500 mg的裝柱量，因此所制備的石墨烯基SPE小柱具有更大的柱容量。這主要歸功于石墨烯納米材料極高的比表面積及其大π共軛結構，可以極大提升BPA在其上的吸附量。由上述結果可知，所制備的石墨烯基SPE小柱具有出更加優異的固相萃取效果。

2.5 方法的準確度和精密度

為驗證所建立的石墨烯基SPE小柱-毛細管電泳聯用方法的準確度和精密度，分別進行了3個濃度的加標回收率實驗。如表2所示，BPA回收率在95.67%～109.50%范圍內，表明所建立的聯用方法可以實現BPA的準確和精密檢測。

表2 方法的穩定性和精密度（n=3）

2.6 奶嘴中BPA測定

自本地超市中購買某品牌嬰兒用奶嘴樣品數只，采用甲醇超聲提取和純水回流提取兩種方法提取其中的BPA。具體過程如下：1）甲醇超聲提取。取1只奶嘴樣品剪成2 mm×2 mm碎片，準確稱取其質量為2.667 4 g。將樣品置于50 mL燒杯中，加20 mL甲醇于超聲下提取1.5 h后用所建立的聯用方法測定其中的BPA。2）純水回流提取。取10只奶嘴樣品剪成2 mm×2 mm碎片，準確稱取質量為27.014 0 g。將樣品置于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL的去離子水，加熱回流2 h后用所建立的聯用方法測定其中的BPA。兩種方法測定BPA的CE圖如圖7所示。將BPA峰面積代入標準曲線，可得每只奶嘴用甲醇超聲提取時的BPA的遷移量為0.004 62 mg/1 000 mL，用純水回流提取時的峰面積極低，未檢出。根據歐盟最新法規（EU 2018/213），要求與食品接觸的塑料制品中雙酚A遷移限量不得超過0.05 mg/1 000 mL（水），并且嬰幼兒用塑料制品中不得遷移出雙酚A。由于本試驗中兩種提取方法均為極端情況下的結果，因此，所購買的嬰兒用奶嘴質量完全符合相關標準。

圖7 兩種提取方法對商品化奶嘴樣品中BPA的檢測

3 結束語

本研究制備了高比表面積的石墨烯為吸附劑的固相萃取小柱，建立了SPE-CE聯用方法用于嬰兒奶嘴中痕量雙酚A的檢測。在最優的實驗條件下，經與商品化的SPE小柱對比，所構建的SPE-CE聯用分析方法對BPA表現出良好的線性關系和較低的檢出限。通過甲醇超聲提取和純水回流提取兩種方法對嬰兒奶嘴實際樣品中痕量BPA進行提取后用所構建的SPE-CE聯用分析方法進行測定，該方法表現出良好的準確性和精密度，可實現實際樣品中痕量BPA的高靈敏快速檢測。本文所構建的聯用方法為食品接觸材料中痕量組分的分析檢測提供了可行的思路，具有較好的應用前景。