普拉洛芬中間體CBP及有關物質的HPLC分離研究

任 霞，高 超，曹慧敏，劉宗銀

(1. 山東瑞安藥業有限公司，山東 濟南 251499; 2. 濟南尚誠醫藥科技有限公司，山東 濟南 250102)

0 引 言

普拉洛芬（2-5H-[1]苯并吡喃[2,3-b]吡啶-7-基丙酸）（PP）為非甾體類抗炎鎮痛藥，主要能抑制體內環氧化酶活性而減少前列腺素的生物合成而發揮解熱、鎮痛、抗炎作用[1]。國內目前僅有兩個廠家的普拉洛芬原料藥獲批上市。國際上，普拉洛芬的制劑包括片劑[2]、口服溶液和滴眼液，而我國上市的為普拉洛芬滴眼液。這幾年，國外也有人不斷嘗試將其開發成納米脂質體[3]及納米凝膠[4-5]，用于治療皮膚性疾?。换驀L試將其制備成納米凝膠[6]及納米顆粒[7]，用于眼部疾病的治療。

7-(2-氯丙?；?-5H-[1]-苯并吡喃[2,3-b]吡啶（CBP）是普拉洛芬合成路線中非常重要的中間體[8]，CBP的合成工藝的優劣、純度、產率、雜質種類及雜質含量等將直接影響最終產品的純度、產率和生產成本，是普拉洛芬原料藥生產質控的重要指標。然而，CBP和有關物質的質量研究尚無報道。

本文擬建立HPLC法對生產過程中的起始原料2-氯煙酸、苯酚、中間體CBP 以及有關物質進行雜質譜研究，建立一種快速準確測定CBP純度和檢驗雜質種類的HPLC方法，避免使用價格較高的其他特殊試劑和特殊色譜柱[9]，為普拉洛芬的工藝優化，重要中間體CBP的質量標準建立提供一種較為科學的分析方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

LC-20AD 高效液相色譜儀（日本島津）；2695型高效液相色譜儀（Waters）；TC-C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，Agilent）；MP C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agela Venusil）；RP18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm，Waters）；ODS-2-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，島津）。

CBP（自制，純度為 99.4%）；2-氯煙酸（來源TCI，純度為 99.8%）；苯酚（來源 TCI，純度為100.0%）；2-苯氧基煙酸（來源 AIFA，純度為98.0%）；5H-[1]-苯并吡喃 [2,3-b]吡啶（BP，自制，純度為99.2%）；7-(2-氯丙?；?-5H-[1]-苯并吡喃[2,3-b]吡啶-5-酮（CBPO，自制，純度為 98.6%）；7-丙?；?5H-[1]-苯并吡喃 [2,3-b]吡啶（PBP，自制，純度為98.1%）；7-(2-氯丙?；?-5H-[1]-苯并吡喃[2,3-b]吡啶-5-醇（CBPL 自制，純度為 98.9%）；7-(2-羥基丙酰基)-5H-[1]-苯并吡喃[2,3-b]吡啶（HBP，自制，純度為98.6%）[10]。上述化合物的結構式見圖1。自制樣品均經過質譜、核磁、元素分析和HPLC（面積歸一化）定性和定量分析。乙腈為色譜純，其余未標明的物質的純度均為分析純。

圖1 幾種化合物的結構式

1.2 CBP的合成路線

本文選擇由2-氯煙酸和苯酚為起始原料的合成路線，該路線的反應條件容易控制，CBP的產率較高。具體反應式見圖2。

圖2 CBP合成反應式

2 實驗方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 雜質對照品儲備液的制備

分別稱取各雜質對照品約15 mg，置50 mL容量瓶中，加乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 CBP供試品溶液的制備

取CBP約1 g，研細，稱取約15 mg，置 50 mL容量瓶中，加乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備

稱取CBP對照品約15 mg，置50 mL容量瓶中，另量取雜質對照品儲備液0.5 mL，置同一50 mL容量瓶中，加乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 色譜條件與系統適應性試驗

2.2.1 色譜條件的篩選

在檢測波長290 nm，柱溫30～35 ℃之間，不同的色譜柱、流動相及不同的流速下，對CBP及其有關物質在不同色譜條件下的色譜行為進行考察。

1）Waters XBridge? Shield RP18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），柱溫 30 ℃，甲醇-水（90∶10），流量在1～1.5 mL/min之間調整，加入三乙胺改善峰型。

2）Agela Venusil MP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫 30 ℃，以 10 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液（用氫氧化鉀溶液調節pH值至6.0）為流動相A，乙腈為流動相B；A∶B在67∶33至25∶75之間進行調整，進行梯度洗脫，流量在1～1.5 mL/min之間調整。

3）Wonda Cract ODS-2-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫35 ℃，以0.05%磷酸溶液為流動相A，甲醇為流動相 B；A∶B在 95∶5至 20∶80之間進行調整，進行梯度洗脫，流量在1～1.5 mL/min之間調整。

4）TC-C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫35 ℃，0.1%磷酸溶液為流動相A，乙腈為流動相 B；A∶B在 70∶30至 20∶80之間進行調整，進行梯度洗脫，流量在1～1.5 mL/min之間調整。經篩選，最終選擇4）為本研究色譜條件。

2.2.2 色譜條件及系統適用性試驗

當選擇色譜柱為TC-C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）時，在流量為 1 mL/min、檢測波長為290 nm、柱溫為35 ℃的情況下，在0.1%磷酸溶液和乙腈分別為流動相A、流動相B的條件下進行梯度洗脫，梯度洗脫[11]設置如表1所示。

表1 流動相體系梯度洗脫設置表

CBP及有關物質可以達到基線分離，主峰與相鄰雜質峰之間最小分離度為2.5，相鄰雜質間分離度均大于2.0；且峰型對稱（不對稱因子在0.8～1.2的范圍內），分析時間小于15 min。圖3為CBP及其有關物質的標準物質色譜圖。

圖3 幾種標準物質的色譜圖

2.3 專屬性試驗

分別精密量取空白溶劑乙腈-水（50∶50）、CBP粗品的供試品溶液、對照品溶液各10 μL進行HPLC檢測。結果顯示，空白溶劑無吸收峰，不干擾供試品有關物質檢查。供試品溶液中，主峰與相鄰雜質峰間最小分離度為2.5，相鄰雜質間最小分離度均大于2.0。

取CBP約1 g，研細，取適量，分別用0.01 mol/L鹽酸溶液、0.01 mol/L氫氧化鈉溶液、30%的雙氧水溶液、90 ℃水浴條件下加熱及置5 000 lx光照4 h等條件進行酸、堿、氧化、高溫、光照破壞[12]，采用二極管陣列檢測器在190～400 nm進行峰純度考察，各主峰純度角值均小于純度閾值，主峰純度良好；各主峰與雜質峰之間分離度大于2.0，分離良好；CBP在氧化、光照破壞條件下較穩定，主要降解雜質為HBP。

專屬性試驗結果說明本色譜條件具有良好的專屬性，可用于CBP及有關物質的分離分析。圖4為CBP樣品破壞前后色譜圖。

圖4 樣品破壞前后色譜圖

2.4 線性關系考察及靈敏度

在上述的色譜工作條件下，對不同濃度的CBP及有關物質混合標準溶液進行HPLC分析，在CBP濃度600 μg/mL的范圍內，其他雜質濃度60 μg/mL的范圍內，濃度C與峰面積A呈良好的線性關系，CBP 線性方程為A=36 392C+531.0（n=7，0.999 7），HBP 線性方程為A=41 579C+41.04(n=7，0.999 8)，CBPL線性方程為A=37 172C+76.58(n=7，0.999 8)，BP線性方程為A=15 596C+174.8(n=7，0.999 6)，PBP 線性方程為A=42 334C+144.2(n=7，0.999 7)，CBPO線性方程為A=23 073C+213.2(n=7，0.999 7)。方法的最低檢測限CBP為5.0 ng/mL、HBP為9.2 ng/mL、CBPL為 10.3 ng/mL、BP為 15.5 ng/mL、PBP為 4.1 ng/mL、CBPO為 20.1 ng/mL（S/N=3）。圖5為CBP及其有關物質的線性關系圖。

圖5 CBP及其有關物質的線性關系圖

2.5 重復性和中間精密度

同一份CBP，平行配置成適宜濃度、相同的6份溶液，由同一人員平行測定6次樣品，結果最大雜質CBPO的RSD為1.66%（n=6），其他雜質總量的RSD為2.94%（n=6）。確定同一份CBP，平行配置成適宜濃度、相同的12份溶液，由不同人員在不同時間和不同儀器上進行檢測，結果最大雜質CBPO的 RSD為2.41%（n=12），其他雜質總量的RSD 為 3.59%（n=12）。

2.6 回收率試驗

分別取雜質對照品儲備液0.3，0.5，0.7 mL各3份，分別置于9個50 mL的容量瓶中，分別稱取9份CBP供試品各約15 mg，置同一50 mL容量瓶中，加乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋至刻度，搖勻，依法測定。CBPO、BP、PBP、CBPL、HBP的平均回收率分 別 為 100.84%、98.62%、99.71%、102.36%、99.53%，RSD分別為 2.16%、1.94%、1.75%、1.69%、1.87%。

2.7 穩定性試驗

取CBP供試品溶液，在室溫下放置，分別于0，2，4，6，8，10 h 取樣進行測定。結果表明，供試品溶液在室溫條件下10 h內，溶液穩定性良好。

綜上所述，總結CBP及有關物質方法學驗證結果如表2所示。

表2 CBP及有關物質方法學驗證結果

3 樣品測定

對兩個精品CBP和兩個粗品CBP分別進行測定，結果表明精品的純度分別為99.51%和99.80%（n=3），粗品的純度分別為90.74%和89.67%（n=3）；粗品中的雜質主要為 CBPO、BP、PBP、CBPL和HBP；精品中的雜質主要為CBPO，CBPO檢出量為0.21%～0.23%，其他最大單雜檢出量均為0.04%～0.05%，總雜質檢出量為0.41%～0.45%，結果見表3。

表3 樣品測定結果（n=3）

4 討 論

4.1 粗品與精品中雜質分布分析

BP為合成CPB的上一步反應物料，HBP為光照及氧化降解雜質，PBP和CBPL均為合成工藝中代入的工藝雜質，但這幾個雜質在精制過程中比較容易除去，殘留較??；CBPO是氧化產物，而CBPO在粗品精制過程中存在不能完全除去的風險。

樣品檢測結果顯示，粗品中均有不同含量的BP、HBP、PBP、CBPL與 CBPO出現，而精品中主要以CBPO為主要雜質，因此在有關物質的測定方法中，建議將CBPO作為已知雜質進行控制。

4.2 CBP有關物質的控制意義

CBP為終產物普拉洛芬的重要中間體。在CBP合成過程中，可產生的雜質主要發生側鏈上的變化，本研究中檢測到的5種有關物質，會在后續成醚及氯化重排成酸的反應中，引發更多側鏈基團的改變，形成復雜的降解雜質、氧化雜質、二聚體等有關物質。其中，CBP中間體CPBO與CBPL后續反應生成物均為普拉洛芬的氧化產物，其理化性質與普拉洛芬十分相似，也是普拉洛芬的主要雜質，精制難以去除，而多次反復精制，會影響終產物的產率，也對精制工藝提出更高要求。

除CBPO、CBPL外的其他有關物質及后續反應生成物，性質與普拉洛芬差異大，易于在后續精制步驟中去除，對終產物質量影響較小?？刂脐P鍵有關物質對普拉洛芬的質量及產率非常重要[13]。

5 結束語

CBP是普拉洛芬合成路線中非常重要的中間體，其質量將對終產物造成直接影響。本方法的建立，為CBP提供了快速、簡便、準確的檢測手段，可更好地服務于普拉洛芬的合成路線及工藝優化，并降低了檢測成本，為提高普拉洛芬終產品的質量與產率提供支持。