狹鱈魚片鹽漬過程中品質及風味物質的變化

井月欣，張 晴 ，馬長偉，張 健, ，李振鐸，劉 昕，劉慧慧，趙云蘋，王共明，劉 芳，曲 敏

（1.山東省海洋資源與環境研究院，山東煙臺 264006；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100000；3.煙臺三江水產有限公司，山東煙臺 264006）

黃線狹鱈（Theragra chalcogramma）又稱阿拉斯加狹鱈，是全球捕撈產量最高的鱈魚品種，廣泛分布于太平洋北部，包括美國阿拉斯加州、俄羅斯等。在我國，黃線狹鱈主要產于黃海東部。狹鱈具有很高的經濟價值，它的蛋白質含量高，而脂肪含量低[1]，適合大規模工廠化加工生產。近年來，鹽漬鱈魚成為我國出口的鱈魚加工新品，由于其風味獨特、易保存，在歐美國家具有廣泛的市場需求[2]。全球鹽漬鱈魚的消費總量每年約為24萬噸，主要包括真鱈、狹鱈等種類。水產品腌制加工是一種常見的保藏方法，此法歷史悠久、產品味道獨特，深受廣大消費者的喜愛。鹽漬可以增加水產品的滲透壓，降低水分活度，達到抑制腐敗變質的作用。由于微生物和一些酶的作用，在鹽漬過程中，水產品的品質和風味逐漸改變，產生了獨特的風味[3]。

近年來，國內外研究者對腌制工藝的優化以及腌制對魚肉品質和風味的影響進行了大量研究和探索。張建梅[4]發現腌制類食物容易產生亞硝酸鹽自熱污染的問題，污染水平一般低于20 mg/kg。陳嬌嬌等[5]研究了不同腌制條件對羅非魚品質的影響，并優化了干腌工藝條件，發現腌制時間對魚肉的氯化鈉含量和氨基肽氮含量有顯著影響，魚肉的氯化鈉含量與腌制鹽度呈正相關。楊華等[6]研究了腌制對紅魚品質的影響，發現腌制方法和工藝條件均對腌制紅魚品質有顯著影響。王騰等[7]研究了超聲波輔助鹽漬對鯇魚理化性質和品質的影響，發現超聲波可以縮短鹽漬時間，抑制微生物的生長。Nguyen等[8]研究了不同鹽水濃度對大西洋真鱈肌肉蛋白質構象的影響，發現鹽濃度的增加促進了蛋白質的變性。曾令彬等[9]研究發現腌制和干燥使臘魚中部分游離氨基酸含量增加，形成臘魚特有風味。Esaiassen等[10]研究了腌制對鱈魚感官品質的影響，發現腌制鱈魚片的氣味和口感比未腌制的鱈魚更好。Rosa等[11]利用GC-MS測定了鹽漬大西洋真鱈的揮發性成分變化，發現脂質和蛋白質的氧化有助于形成鹽漬鱈魚的特有風味。Barat等[12]分別用不同的鹽水濃度腌制大西洋真鱈，發現在鹽水濃度較高時，由于蛋白質鹽析，魚肉的蛋白質結構發生較大變化，產品含鹽量較高且得率較低。Cui等[13]采用頂空-氣相色譜-離子遷移技術（HSGC-IMS）對不同烹飪方法的魷魚樣品的揮發性物質進行了測定，發現腌制魷魚具有獨特的特殊風味化合物，不同的烹飪方法可以影響魷魚的香氣。龐一揚等[14]發現魚肉腌制前后的揮發性成分發生了明顯變化，腌制過程中魚肉的腥味成分減少，醛酮類、酯類物質增加。

目前，國內外學者對鹽漬鱈魚的研究以大西洋真鱈（Gadus morhua）為主，鹽漬狹鱈的企業標準化加工以及品控缺少基礎研究，對狹鱈在鹽漬過程中發生的品質和風味變化研究甚少。因此，本文以狹鱈魚片為原料，采用前期優化的鹽漬工藝鹽漬狹鱈魚片，研究鹽漬過程中狹鱈魚片的品質變化，以期為加工出口型鹽漬狹鱈產品提供理論支撐，并為鱈魚深加工及其他魚類加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

去骨去刺去皮狹鱈魚片（重量為4～6盎司） 煙臺嘉鴻食品有限公司；食用無碘鹽 山東省鹽業集團有限公司；正己烷（色譜純）、三氯乙酸、三氯甲烷、乙二胺四乙酸（EDTA）、2-硫代巴比妥酸、冰乙酸、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硼酸鈉、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、瓊脂糖、鹽酸、乙酰氯、無水甲醇、碳酸鉀、甲醛、乙醇 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；總氨基酸測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；Lowry法蛋白濃度測定試劑盒、彩虹245廣譜蛋白Marker 北京索萊寶科技有限公司；DNA抽提試劑盒 美國MP Biomedicals公司；DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

METTLER TOLEDO電子分析天平 瑞士/梅特勒托利多；DHG-9053A電熱鼓風干燥箱 上海沙鷹科學儀器有限公司；HH-4電熱恒溫水浴鍋 山東省煙臺龍口市先科儀器公司；GC-2010高效氣相色譜分析儀 日本島津公司；Multiskan GO酶標儀

美國ThermoFisher公司；XW-80A旋渦混合器 上海精科實業有限公司；FlavourSpec?風味分析儀

濟南海能儀器股份有限公司；YC-520L醫用冷藏箱

中科美菱低溫科技股份有限公司；DZQ真空包裝機 上海阿凡佬機械有限公司；DHG-9053A電熱鼓風干燥箱 上海沙鷹科學儀器有限公司；LEICA ICC50HD顯微鏡 德國萊卡公司；FD-2A冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 狹鱈魚片預處理 采用注水法，在4 ℃下用純水解凍狹鱈魚片1 h，將其逐個清洗控干備用。

1.2.2 狹鱈魚片鹽漬工藝 采用干腌法，取漏網塑料筐（規格：37 cm×35 cm×3.5 cm）若干，底部用保鮮膜鋪好，均勻地撒一層鹽，再將狹鱈魚片擺在塑料筐中，一層鹽，一層狹鱈魚片，每層鹽都要均勻覆蓋魚肉表面，最后一層為鹽，擺好后放置冷藏箱進行鹽漬，鹽漬條件為加鹽量100%（w/w），鹽漬時間15 d，鹽漬溫度10 ℃。分別在鹽漬0、3、6、9、12、15 d取樣，測定其脂肪氧化程度、亞硝酸鹽含量、脂肪酸含量、游離氨基酸總量、蛋白質降解、微觀組織結構和揮發性風味成分。

1.2.3 脂質氧化程度的測定 采用蔡文強等[15]的方法，并略作修改。將去除表面食鹽的狹鱈魚片研碎，準確稱取10 g研碎后的魚肉于錐形瓶中，加入50 mL 7.5%的三氯乙酸溶液（含0.1%的EDTA），用搖床振搖30 min后，雙層濾紙過濾。取5 mL上清液于帶塞比色管中，加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，塞緊管口，沸水浴40 min，冷卻至室溫后，轉移至離心管中，1500 r/min離心25 min。取上清液，加入5 mL三氯甲烷并搖勻，靜置分層后取上清液，測定在532和600 nm波長處的吸光值，同時做試劑空白，平行測定三次，結果取平均值，用以下公式計算TBA值。

式中：A532、A600分別為在532、600 nm處的吸光值；155為丙二醛的毫摩爾吸光系數；72.06為丙二醛的分子量；m為稱取的樣品質量，g。

1.2.4 亞硝酸鹽含量的測定 亞硝酸鹽含量依據GB/T 5009.33-2016測定[16]。

1.2.5 脂肪酸含量的測定 參照譚青等[17]的方法，并稍作更改。將去除表面食鹽的狹鱈魚片真冷凍干燥，取100 mg凍干的樣品于消化管中，加入2 mL 10%乙酰氯甲醇溶液（乙酰氯:無水甲醇=1:10）、1 mL正己烷，塞緊蓋子后混勻。于80 ℃金屬浴中甲酯化2 h，冷卻至室溫，加入5 mL 6% K2CO3、2 mL正己烷，振蕩后靜置10 min。取上清液，用0.22 μm濾膜過濾至脂肪酸測定小瓶，采用氣相色譜儀分析，色譜柱為SP-2560氣相色譜柱（100 mm×0.25 mm×0.2 mm），進樣量為1 μL，根據脂肪酸標準品的保留時間進行定性。

1.2.6 游離氨基酸總量的測定 采用總氨基酸測定試劑盒的比色法進行氨基酸總量的測定；采用Lowry法蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度的測定。

1.2.7 SDS-PAGE電泳 參考劉家維等[18]的方法并作適當修改。制備分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，加入玻璃板中。將樣品與5×上樣緩沖液（40 μL+10 μL）混勻，沸水浴5 min后上樣，樣品上樣量為10 μL，彩色245廣譜蛋白Marker上樣量為5 μL。以80 V的恒壓進行電泳，當樣品進入分離膠時，將電壓改為120 V，待溴酚藍跑到膠的底部時停止電泳。取出凝膠，使用考馬斯亮藍染液染色30 min后倒掉。用蒸餾水清洗凝膠2～3次，加入脫色液，放在搖床上振搖，每30 min更換一次脫色液，直至得到清晰的條帶。隨后，用凝膠成像分析儀進行拍照分析。

1.2.8 微觀組織結構觀察 根據沈暉等[19]的方法進行石蠟切片，并稍作修改。用手術刀片把樣品切成3 mm×3 mm×3 mm的大小，配制含苦味酸飽和液（1.22%）75 mL、福爾馬林25 mL、乙酸5 mL的Bolin氏液作為固定液，將樣品置于固定液中固定23 h，置于70%乙醇中進行置換。隨后將樣品放入全自動組織脫水機中，進行乙醇梯度脫水、二甲苯透明和浸蠟。浸蠟之后，用鑷子取樣，使用石蠟包埋機，于5 cm×3 cm×3 cm的紙盒內進行包埋，包埋后迅速冷卻。修剪石蠟塊，用旋轉切片機切片，每片厚度為4 μm，取至少3片完整的連續切片，于40 ℃的水浴中展片，轉移至載玻片，置于烘箱中（37 ℃）烘干。烘干的切片經脫蠟、蘇木精-伊紅染色、乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，用中性樹膠封片，蓋上蓋玻片，置于烘箱（37 ℃）烘片48 h，用電子顯微鏡觀察、拍照。

1.2.9 揮發性風味成分的測定 采用HS-GC-IMS技術，使用FlavourSpec?風味分析儀測定鹽漬狹鱈樣品中的揮發性成分。稱取2 g鹽漬狹鱈樣品，置于20 mL頂空瓶中，在60 ℃孵育15 min后，直接頂空進樣，進樣量為500 μL。參考Zhang等[20]的方法，設定分析條件見表1。

表1 HS-GC-IMS分析條件Table 1 Experimental conditions of HS-GC-IMS

1.3 數據處理

所有實驗均重復3次，實驗結果以平均值±標準差表示。采用SPSS23.0以及Microsoft Office Excel 2016完成數據的處理及分析。

2 結果與分析

2.1 鹽漬過程中鹽漬狹鱈魚片脂質氧化程度的變化

在魚腌制過程中，脂肪氧化對魚類腌制產品的感官、風味、品質特性起著重要的作用[21]。由圖1可知，隨著鹽漬時間的增加，魚肉的TBA值由0.14 mg/kg升至0.26 mg/kg，呈緩慢上升趨勢，說明脂質在鹽漬過程中發生了氧化，此階段主要是脂肪氧化酶的作用。TBA值均小于1.0 mg/kg，說明鹽漬狹鱈魚片的脂質氧化程度均在安全范圍內[22]。

圖 1 鹽漬過程中鹽漬狹鱈魚片脂質氧化程度的變化Fig.1 Changes of degree of lipid oxidation of dry-salted Alaska pollock fillets during salting

2.2 鹽漬過程中鹽漬狹鱈魚片中亞硝酸鹽含量的變化

由圖2可知，隨著鹽漬時間的增加，狹鱈魚片中的亞硝酸鹽含量呈先上升后下降的趨勢，鹽漬后亞硝酸鹽含量由2.00 mg/kg增加到2.91 mg/kg，小于國標規定的30 mg/kg，說明鹽漬使魚肉中亞硝酸鹽的含量增加，且在安全范圍內[23]。由于魚體本身就含有硝酸鹽和亞硝酸鹽，在鹽漬前期，一部分硝酸鹽被硝酸鹽還原菌還原，生成亞硝酸鹽，因此亞硝酸鹽的含量升高；在鹽漬中后期，亞硝酸鹽被其他微生物還原成氮氣、氨氣等氣體，而且由于鹽漬后期魚肉含鹽量的升高，硝酸鹽還原菌的活性受到抑制，因此亞硝酸鹽的含量下降[24]。另外，由于鹽漬狹鱈魚片加工過程中未額外添加硝酸鹽和亞硝酸鹽，因此亞硝酸鹽的含量總體處于較低水平。這與劉敏[25]的研究結果類似，在腌制過程中，鰳魚的亞硝酸鹽含量先增加后減少，且在腌制第6 d達到最大值。

圖 2 鹽漬過程中鹽漬狹鱈魚片亞硝酸鹽含量的變化Fig.2 Changes of the content of nitrite in dry-salted Alaska pollock fillets during salting

2.3 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片脂肪酸含量的影響

采用氣相色譜檢測到鹽漬過程中魚肉20種脂肪酸含量的變化，結果見表2。在鹽漬過程中，鹽漬狹鱈魚片的飽和脂肪酸總量略升高，其中硬脂酸（C18:0）含量最高，且在鹽漬過程中（3、6、12、15 d）顯著升高（P＜0.05）；單不飽和脂肪酸中，十五碳烯酸（C15:1）的含量最高，油酸（C18:1n-9c）含量僅次于十五碳烯酸的含量，且兩者的含量在鹽漬過程中呈升高趨勢，說明脂肪酸水解的產物主要是十五碳烯酸和油酸；多不飽和脂肪酸中，DHA含量最高，其次是EPA，且兩者的含量在鹽漬過程中均呈下降趨勢。以上結果表明脂質在鹽漬過程中發生了氧化，且以多不飽和脂肪酸氧化為主。這與郭雅[26]的研究結果一致，在腌制過程中，風干鳊魚的多不飽和脂肪酸含量減少，飽和脂肪酸含量明顯升高。

表2 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片的脂肪酸組成及含量的影響Table 2 Effect of salting on fatty acid composition and content of dry-salted Alaska pollock fillets

2.4 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片中游離氨基酸總量的影響

由圖3可知，隨著鹽漬時間的增加，狹鱈中游離氨基酸總量先急劇減小，再逐漸增加。這可能是因為鹽漬前期水分的大量流失，導致游離氨基酸也跟著流失；鹽漬中后期，魚肉中蛋白質在蛋白酶、氨肽酶的作用下水解，生成了游離氨基酸，因此游離氨基酸總量逐漸增加。

圖 3 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片中游離氨基酸總量的影響Fig.3 Effect of salting on the total free amino acids in drysalted Alaska pollock fillets

圖 4 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片中蛋白質降解的影響Fig.4 Effect of salting on the protein degradation of dry-salted Alaska pollock fillets

2.5 鹽漬對魚肉中蛋白質降解情況的影響

由圖4可知，隨著鹽漬時間的增加，在100～245 kDa之間的條帶顏色明顯變淺，說明大分子蛋白在鹽漬過程中逐漸降解；肌動蛋白（48 kDa）在鹽漬過程中（9～15 d）逐漸增加；分子量在20 kDa以下的蛋白發生部分降解。這可能是因為，在鹽漬過程中，某些蛋白在高鹽的作用下析出并降解，生成了分子量更小的蛋白片段，并進一步反應生成鹽漬狹鱈魚片的滋味物質[27]。鹽漬的低溫環境抑制了組織蛋白酶的活性，使蛋白質降解較緩慢。

2.6 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片微觀組織結構的影響

在顯微鏡放大倍數為20倍時，狹鱈肌纖維橫截面的微觀結構如圖5，可以看到鹽漬前魚肉肌纖維的橫截面呈規則的長圓形且大小相似，細胞間隙較均勻；而隨著鹽漬時間的增加，肌纖維的橫截面變得不規則，肌纖維明顯收縮，細胞間隙先變大后變小。這些變化可能是由蛋白質鹽析和肌肉結構成分的酶降解引起的。這與大西洋真鱈在鹽漬過程中的微觀結構變化相似，Thorarinsdottir等[28]研究發現，腌制使大西洋真鱈肌肉纖維收縮，且擴大了細胞間隙。

圖 5 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片微觀結構的影響Fig.5 Effect of salting on microstructure of dry-salted Alaska pollock fillets

2.7 鹽漬對鹽漬狹鱈魚片中揮發性風味成分的影響

從圖6和表3中對比分析可知，不同鹽漬時間下狹鱈中的揮發性成分顯示了較大差異（紅色框區域）?？梢钥吹?，鹽漬15 d后，壬醛、2-甲基丙醛、1-己醇、3-甲基-1-丁醇、異丙醇、乙酸丁酯、乙酸丙酯、2-丁酮、2,3-丁二酮、2-丙酮等物質的含量顯著降低（P＜0.05）。其中壬醛主要來源于油酸的氧化，呈魚腥味[29]；3-羥基-2-丁酮呈黃油味，2-丁酮呈辛辣味，為魚類腐敗的主要物質[30]，鹽漬過程中這些物質的相對含量降低，說明鹽漬降低了魚肉的魚腥味，且魚肉的整體風味得到改善。隨著鹽漬時間的增加，庚醛、己醛、酯類、醇類物質等相對含量增加，其中，庚醛呈焦香味和油脂味，己醛呈青草味，均來源于亞油酸氧化，且閾值較低，鹽漬過程中其相對含量均呈增加趨勢，對鹽漬狹鱈的風味起到了積極的作用；酯類、醇類物質相對含量均明顯增加，其中，乙酸乙酯呈果香，且閾值較低，其相對含量在鹽漬15 d后顯著增加（P＜0.05），對鹽漬狹鱈的風味起到了積極的作用。

圖 6 不同鹽漬時間下鹽漬狹鱈魚片揮發性成分指紋譜圖Fig.6 Fingerprint of volatile organic compounds in dry-salted Alaska pollock fillets at different salting time

續表3

3 結論

本文采用加鹽量100%（w/w），鹽漬時間15 d，鹽漬溫度10 ℃的條件鹽漬狹鱈魚片，研究鹽漬過程中狹鱈魚片的品質變化。隨著鹽漬時間的增加，狹鱈魚肉的TBA值由0.14 mg/kg升至0.26 mg/kg，亞硝酸鹽含量由2.00 mg/kg增加到2.91 mg/kg，兩者均在安全范圍內。在鹽漬過程中，鹽漬狹鱈魚片的飽和脂肪酸中硬脂酸（C18:0）和單不飽和脂肪酸中十五碳烯酸（C15:1）和油酸（C18:1n-9c）含量在鹽漬過程中呈升高趨勢，多不飽和脂肪酸中DHA和EPA含量在鹽漬過程中均呈下降趨勢，鹽漬過程中以多不飽和脂肪酸氧化為主。隨著鹽漬時間的增加，狹鱈中游離氨基酸總量呈現先減少后增加，大分子蛋白在鹽漬過程中逐漸降解，在100～245 kDa之間的條帶顏色明顯變淺，肌動蛋白（48 kDa）逐漸增加；在20 kDa以下的蛋白發生部分降解，肌纖維的橫截面變得不規則，肌纖維明顯收縮，細胞間隙先變大后變小。在鹽漬過程中，鹽漬狹鱈魚片的腥味成分減少，酯類、醇類物質含量增加。關于狹鱈魚片鹽漬過程中微生物群對其品質的影響還需進一步研究探討，以期為加工出口型鹽漬狹鱈產品提供了理論支撐，并為鱈魚深加工及其他魚類加工提供了理論支持和參考。