焦糖化與美拉德反應中DDMP、HMF及糠醛的生成研究

王 丹，況丹妮，劉若陽，張志軍，侯天宇，李 河

（中北大學化學工程與技術學院，山西太原 030051）

食品在貯藏、熱加工及發酵過程中會產生一些有苦味或對人體存在健康威脅的化合物，如2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮（DDMP）、5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，HMF）及糠醛。它們主要來源于食品加工貯藏過程中的焦糖化反應（Caramelization）和美拉德反應（Maillard Reaction，MR）[1-2]。在沒有氨基存在時，糖類尤其是單糖，加熱會發生脫水與降解，當溫度高達熔點以上會發生褐變，即發生焦糖化反應。當有氨基（源于銨根離子、氨基酸、多肽或者蛋白質）參與時，還原糖的羰基還會與氨基經縮合、聚合而最終生成類黑精，即發生MR[2]。由于焦糖化和美拉德反應在食品中的廣泛存在，DDMP、HMF及糠醛在蜂蜜[3-4]、蔬菜[5]、水果[6]、調味品[7]、烤面包[8]、飲料[9]等多種食品中被發現。

作為焦糖化或美拉德反應的中間產物，DDMP、HMF和糠醛可以繼續反應生成棕色及香味物質，具有增香調色功能[10]，但對人體是否有害，目前尚存在爭議。HMF和DDMP被認為是中草藥中的有效活性分子[11-12]，如HMF 在體外具有抗酪氨酸酶活性的作用[13]，DDMP具有強抗氧化性[14-15]，可以抑制人結腸癌細胞增殖，促進其凋亡[16]。然而，研究表明，糠醛或HMF被機體吸收后，會對肝臟、腎臟、心臟等器官產生不良影響[17]；HMF能損害老鼠的DNA，誘發大鼠的結腸癌和引起中毒性腎損害[18]，對眼黏膜、上呼吸道黏膜等產生刺激作用[19-20]。DDMP會在體外誘導DNA鏈發生斷鏈和突變[21]，也會刺激大鼠體內自主神經活動[22]。此外，糠醛、HMF和DDMP帶有苦味，會影響食品的可接受度[8,23]。因此，DMP、HMF和糠醛仍然被認為是許多食品中嚴格控制的成分，進一步了解它們在不同MR體系中的形成途徑，對于在實際應用中合理管理食品加工和貯藏具有重要意義[24]。目前，糠醛被允許作為香料使用，但在不同食品中有明確限量[1]；歐洲食品安全委員會推薦HMF的最大限量為1.6 mg/人/d；Janzowski等[25]認為攝入HMF 0.5～1.0 mg/kg沒有健康威脅。

目前大部分研究著重關注HMF的生成。盧鍵媚等[26]建立了糖-酸模型體系，研究了反應條件對3-DG和HMF生成的影響，結果表明，果糖和蔗糖反應體系中3-DG和5-HMF生成量遠高于葡萄糖反應體系。歐雋瀅等[24]研究了5種添加物對模型體系中HMF的生成影響，證實碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽在模擬體系和餅干中可以顯著減少 HMF 形成；硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨則大幅增加HMF生成量。Gükmen等[6]基于水果貯藏過程中二羰基化合物與HMF的存在情況，討論了美拉德反應在水果中的新角色。關于DDMP、HMF和糠醛在焦糖化和美拉德反應體系共同生成規律的研究不多，本文通過建立3種焦糖化體系、3種美拉德體系，探究不同反應體系，不同單糖種類以及賴氨酸的引入對DDMP、HMF和糠醛生成的影響，以期為食品貯藏、熱加工提供有效的安全引導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-果糖（純度≥99.0%）、D-木糖（純度≥98.0%）、L-賴氨酸（純度≥99.0%）、5-羥甲基糠醛（HMF）、糠醛、鄰苯二胺（OPD，純度≥99.0%） 上海阿拉丁生化技術有限公司；D-葡萄糖 純度≥99.5%，天津市化學試劑三廠；3-脫氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone, 3-DG） 上海紫霞生物科技有限公司；磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O） 純度≥99.0%，天津市風船化學化學試劑有限公司；DDMP 由實驗室自行制備分離得到，其詳細信息見已發表的文獻[27]。

SB25-12DTD超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；CTL550低速離心機 湖南湘立儀器有限公司；XW-80A渦旋混合器 上海馳唐電子有限公司；ZYCGF-III-20T超純水制備系統 四川卓越水處理設備有限公司；BCD-576WDPU冰箱海爾公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀 美國熱電公司；pH計 上海美普達儀器有限公司；DF-II數顯集熱式油浴磁力攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；LC-DCY-12G氮吹儀 上海力辰儀器科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 焦糖化反應體系的制備 準確稱取1.0 mol木糖（Xyl）、葡萄糖（Glc）和果糖（Fru），分別溶解于適量的磷酸鹽緩沖液（0.2 moL/L，pH5.8）中，并用該緩沖液定容至1000 mL，得到濃度為1.0 mol/L的單糖溶液。利用移液槍準確移取5.0 mL上述溶液至耐高溫消解管中，螺旋蓋密封，置于120 ℃油浴鍋中分別加熱10、30、60、90、120 min，每組做兩個平行。所有樣品溶液反應完成后，立即取出置于冰水中以終止反應。冷卻后的樣品溶液移入10 mL離心管，置于4 ℃冰箱中待測。

1.2.2 美拉德反應體系的制備 準確稱取1.0 mol Xyl和賴氨酸（Lys）、Glc和Lys，以及Fru和Lys，分別溶解于適量的磷酸鹽緩沖液（0.2 moL/L，pH5.8）中，并用該緩沖液定容至1.0L，分別得到濃度為1.0 mol/L，摩爾比1:1的Xyl-Lys、Glc-Lys、Fru-Lys三種體系的溶液。準確吸取5.0 mL上述溶液到耐高溫消解管中，旋緊瓶蓋，置于120 ℃油浴鍋中分別加熱10、30、60、90、120 min，每組做兩個平行。所有樣品溶液反應完成后，立即取出置于冰水中以終止反應。冷卻后的樣品溶液移入10 mL離心管，置于4 ℃冰箱中待測。

1.2.3 DDMP、HMF及糠醛的測定

1.2.3.1 標準品溶液制備 準確稱取DDMP、HMF和糠醛標準品各10 mg，分別用超純水溶解并定容到10 mL容量瓶中，得到每種標準品濃度為1.0 mg/mL的標準貯備液。分別用甲醇水溶液（甲醇:水=1:4，v/v）進行梯度稀釋，得到濃度為1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 mg/L的混合標準工作液，經0.22 μm水系濾膜過濾后，上機測定。

1.2.3.2 樣品溶液的處理 所有反應溶液經0.22 μm水系濾膜過濾后，HPLC檢測，其中木糖-賴氨酸、葡萄糖-賴氨酸體系分別稀釋10倍和5倍后檢測。

1.2.3.3 色譜分析條件 參考課題組已發表文獻[28]，采用高效液相色譜法（HPLC）對3種物質進行測定，其中單獨標準品進行定性分析，混合標準品進行定量分析。色譜條件如下：色譜柱：Hypersil GOLDTMC18（5 μm，250×4.6 mm）；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；流速1.0 mL/min；檢測波長284 nm；流動相：A相為甲醇，B相為水，梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1 DDMP、HMF和糠醛的HPLC梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution procedure for the analysis of DDMP,HMF and furfural by HPLC

1.2.4 3-DG的測定

1.2.4.1 標準品及樣品衍生化 準確稱取3-DG標準品10 mg，用去離子水溶解并定容到10 mL容量瓶中，得到3-DG標準品濃度為1.0 mg/mL的標準貯備液。參考課題組已發表文獻[28]，取不同體積的標準品儲備液與800 μL鄰苯二胺（1.0mg/mL于pH7.0的磷酸緩沖液中）混合均勻，37 ℃水浴衍生化12 h，得到濃度分別為1、2、5、10、20 mg/L的標準品衍生化溶液，相同條件下，取200 μL反應溶液與800 μL鄰苯二胺衍生化，過0.22 μm水系膜，待測。

1.2.4.2 色譜分析條件 采用高效液相色譜法（HPLC）對3-DG進行測定，色譜條件如下：色譜柱：Hypersil GOLDTMC18（5 μm，250×4.6 mm）；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；流速0.6 mL/min；檢測波長315 nm；流動相：A相為甲醇，B相為水，梯度洗脫，洗脫條件見表2。

表2 3-DG測定的HPLC梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions for 3-DG determination by HPLC

1.2.5 中間和終末產物分析 參照文獻[27]，采用紫外分光光度法測定反應體系樣品的中間產物和褐變產物。根據實驗室分光光度計準確度，所有樣品稀釋后吸光度為0.2～0.8時，記錄數據，以記錄數據乘以稀釋倍數為最終結果作為中間產物和終末產物的含量。

1.3 數據處理

本文實驗數據均為兩次重復，實驗結果表達為平均值±標準差。數據先采用Excel進行數據歸一和初始分析處理。運用Origin 2018進行作圖和擬合處理，運用SPSS18.0進行方差分析，不同字母表示在兩組之間有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 HPLC檢測DDMP、HMF和糠醛

一般美拉德反應體系常由等摩爾的羰基和氨基構成[27]，作為人體必需氨基酸之一，賴氨酸在食品原料中廣泛存在[29]，因此本實驗選擇賴氨酸參與的美拉德模型作為研究對象。采用HPLC對焦糖化和美拉德反應體系中的DDMP、HMF和糠醛進行檢測，圖1為三種物質標準品、焦糖化樣品和美拉德樣品的液相色譜圖。三種物質的保留時間、線性方程及相關系數見表3。如圖1所示，在1.2.3.3的色譜條件下，三種物質在10 min實現完全分離，峰型和分離度均較理想。不同反應樣品的基質簡單，色譜圖未見明顯干擾，可以準確對三種化合物進行積分和定量分析。圖1C中美拉德反應樣品DDMP生成量較大，定量時需稀釋后分析，為便于比較，使用了稀釋前的樣品。

表3 三種物質的保留時間、線性方程及決定系數Table 3 Retention time, linear equation and correlation coefficient of three compounds

2.2 不同體系中DDMP、HMF和糠醛的生成規律

2.2.1 DDMP的生成 不同焦糖化及美拉德反應體系中DDMP的生成規律見圖2，由圖2可知，隨著加熱時間的延長，焦糖化體系中的DDMP含量逐漸升高，其DDMP含量順序為果糖＞木糖＞葡萄糖，葡萄糖加熱時沒有DDMP檢出；而美拉德體系中DDMP呈先增加后降低的趨勢，這是因為DDMP不穩定，在反應中會發生降解[30]，在反應前期，DDMP急劇累積，后期隨著底物消耗，降解速度大于生成速度，DDMP含量下降。DDMP在美拉德體系中的生成量（最大為125.11±1.54 mg/L）遠遠大于焦糖化體系（最大為3.21±0.18 mg/L），其順序為木糖-賴氨酸＞葡萄糖-賴氨酸＞果糖-賴氨酸，與焦糖化體系差異較大。這表明賴氨酸的參與促進了DDMP的生成。

2.2.2 HMF的生成 不同焦糖化及美拉德反應體系中HMF的生成規律見圖3，由圖3可知，隨著加熱時間的延長，兩種體系中的HMF含量逐漸升高（P＜0.05），經過方差和多重比較分析發現，焦糖化體系中HMF含量順序為果糖最高，葡萄糖次之，木糖最少；而美拉德體系中葡萄糖-賴氨酸中的含量與果糖-賴氨酸沒有顯著性差異，木糖-賴氨酸體系中沒有HMF檢出；由圖3可知，對比果糖和果糖-賴氨酸體系，賴氨酸的參與反而抑制了HMF的生成。

圖 1 3種物質標準品與樣品的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standards and samples

2.2.3 糠醛的生成 不同焦糖化及美拉德反應體系中糠醛的生成規律見圖4，由圖4可知，糠醛主要在焦糖化體系中生成，并且木糖體系中糠醛的生成量遠遠大于其他體系，木糖是五碳糖，五碳糖降解易生成糠醛，這與前人報道的結果一致[1]。三種美拉德體系中均沒有糠醛檢出。這說明賴氨酸的參與也抑制了糠醛的生成。

圖 2 焦糖化和美拉德反應中DDMP的生成Fig.2 Formation of DDMP in caramelization and Maillard reaction

圖 3 焦糖化和美拉德反應中HMF的生成Fig.3 Formation of HMF in caramelization and Maillard reaction

2.3 3-DG的生成

1-DG和3-DG分別是焦糖化和美拉德反應體系中DDMP和3-DG的前體物質，由于目前缺乏1-DG標品，本實驗只測定了不同體系中3-DG中的含量。如圖5所示，在焦糖化體系中，3-DG的生成規律與HMF一致，這說明果糖焦糖化體系中HMF生成量的增加主要取決于果糖降解生成較多的3-DG。然而在美拉德體系中，3-DG在木糖/果糖-賴氨酸體系中沒有檢出，在葡萄糖-賴氨酸體系加熱初期生成較多，30 min之后逐漸降解，直至無法檢出。下文將結合反應強度綜合討論DDMP、HMF及糠醛的生成途徑。

圖 4 焦糖化和美拉德反應中糠醛的生成Fig.4 Formation of furfural in caramelization and Maillard reaction

圖 5 焦糖化和美拉德反應中3-DG的生成Fig.5 Formation of 3-DG in caramelization and Maillard reaction

2.4 DDMP、HMF及糠醛生成途徑分析

一般認為，在焦糖化反應中，戊糖脫水反應后生成糠醛[1]，己糖經脫水后生成 HMF和DDMP，而反應劇烈時，HMF會裂解為糠醛[23]。在MR中，氨基和羰基先形成席夫堿，席夫堿重排生成阿馬道里重排產物（Amadori rearrangement products，ARPs）或者海因斯重排產物（Heyenes rearrangement products，HRPs）。當反應體系pH≤7時，ARPs或者HRPs主要發生1,2-烯醇化形成二羰基化合物 3-脫氧葡萄糖醛酮（3-DG），后環化形成糠醛及HMF等[26]；當反應體系pH＞7 時，ARPs或者HRPs則發生2,3-烯醇化反應、產生1-脫氧葡萄糖醛酮（1-DG），之后環化形成DDMP[31]。HMF和DDMP既在焦糖化反應中生成，也在MR中生成，兩者隨著反應體系及條件的變化存在競爭關系。三種物質在焦糖化和美拉德體系下的生成路徑見圖6[28,32]。

最近的研究表明干熱或低水分時，葡萄糖-脯氨酸體系易發生2,3烯醇化，更多地生成DDMP[28]，由此可見，除pH以外，水分含量及氨基酸活性也會影響DDMP和HMF的生成。反應產物的生成含量與底物濃度、反應溫度、時間、體系pH等因素有關，而這些因素都會直接影響反應強度[28]。一般通常用反應物消耗、初級、中間及終末成色產物（brown products，BPs）的生成來表征美拉德反應進程。Li等[27]證實無色中間產物（uncolored intermediate products，UIPs）是美拉德反應中BPs的主要前體物質，一般用294 nm處的紫外吸收值（A294）來表征，標志著顏色變化的開始。UIPs主要包括糖基化產生的醛類、酮類等物質[33]。一般用420 nm處的吸光值來表征BPs的生成，表示美拉德反應的褐變程度[34]。本文采用A294和A420表征反應強度。

三種焦糖化體系的美拉德反應均不劇烈，A420很小，幾乎沒有成色物質生成。A294值也并沒有顯著性差異（數據未給出），這表明在反應強度相近的情況下，單糖結構是影響DDMP、HMF和糠醛的主要因素。焦糖化體系中3-DG的含量與HMF生成一致，均為果糖＞葡萄糖＞木糖。圖7為美拉德反應體系中反應強度的變化。由圖7可知，美拉德反應的強度要遠遠大于焦糖化體系。DDMP生成與A294的趨勢呈正相關，均為木糖-賴氨酸＞葡萄糖-賴氨酸＞果糖-賴氨酸。然而HMF和糠醛的生成卻呈現不同的趨勢。盡管木糖-賴氨酸體系的A294值最大，但該體系中卻沒有HMF和糠醛檢出。相反HMF更容易在葡萄糖/果糖-賴氨酸體系中生成。這主要是因為HMF還有一個關鍵的不飽和前體物質3,4-DGE（圖6），3,4-DGE存在Z和E兩個異構體，只有Z能夠形成HMF[35-36]。無論是DDMP、HMF、糠醛，還是3-DG，在強度很大的美拉德反應中，均屬于動態變化。隨著反應物的消耗，DDMP會進一步分解生成小分子酮類及其他裂解產物，而HMF會進一步參與到褐變反應，生成BPs。對比A420值發現，隨著反應時間的延長，三種美拉德體系的褐變值逐漸接近。在120 min時，木糖-賴氨酸體系有半固態樹脂化產物生成，導致A420測定值降低。這說明，木糖-賴氨酸中中間產物更快地參與到了褐變反應中。3-DG除了脫水環化生成HMF之外，還會發生反縮醛化生成丙酮醛等小分子醛類[37]，進一步參與到高級反應階段。因此，在美拉德體系中監測到的3-DG變化只是一個靜態值，并不能直接反映體系中3-DG是否產生（圖5B）。Kanzler等[36]報道發現在麥芽糖-脯氨酸和麥芽糖-丙氨酸體系中，沒有檢測到1-DG和3-DG，但DDMP濃度卻分別達到113和138 μmol/L。這意味著二羰基化合物真實產生過，但由于反應過于劇烈沒有被追蹤到。

圖 6 己糖焦糖化和美拉德反應中DDMP、HMF和糠醛的生成路徑Fig.6 Proposed formation pathway for DDMP, HMF and furfural from caramelization and Maillard reaction models

圖 7 美拉德反應中中間產物（A294）和終末產物（A420）的變化Fig.7 Evolution of the absorbance at 294 nm (A) and 420 nm(B) as indicators of intermediate and advanced stages of MR, respectively

3 結論

本文基于120 ℃油浴加熱，建立了木糖、果糖、葡萄糖焦糖化體系及木糖/果糖/葡萄糖-賴氨酸美拉德體系來研究DDMP、HMF和糠醛的生成規律。結果表明，體系生成的三種物質含量隨著加熱時間的延長而增加。果糖焦糖化體系中HMF的生成量最高，木糖焦糖化體系中糠醛的含量最高，賴氨酸通過競爭性抑制單糖降解的焦糖化途徑抑制HMF和糠醛的生成。DDMP在果糖和木糖焦糖化體系中均有生成，但含量不高。賴氨酸的參與促進了美拉德體系中DDMP的大量生成，尤其在木糖-賴氨酸體系中，DDMP的含量達到了125.11±1.54 mg/L。結合A294和A420結果可知，單糖結構差異與賴氨酸競爭性參與單糖降解是影響DDMP、HMF和糠醛生成的主要因素。