抗食品腐敗真菌的乳酸菌篩選、復(fù)配及混合發(fā)酵工藝優(yōu)化

杜瑩瑞，李市場(chǎng)，馮騰柱，張亞娟，陳 妍，龔明貴

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471023）

在食品工業(yè)中，真菌污染及其毒素是造成經(jīng)濟(jì)損失、危害消費(fèi)者健康的重要原因[1]。真菌及毒素大部分具有高毒及致癌性，極易在各類食品中存在，嚴(yán)重影響食品的安全和消費(fèi)者健康[2]。食品腐敗真菌在市場(chǎng)上大多采用食品添加劑進(jìn)行食品防腐，而添加劑屬于化學(xué)物品且大多都是國(guó)家禁止使用的[3]。因此，對(duì)抗食品腐敗真菌混合菌的篩選及發(fā)酵工藝的優(yōu)化是迫切需要的。

乳酸菌和丙酸桿菌單獨(dú)發(fā)酵的發(fā)酵液具有一定的抗真菌活性[4-7]，但活性較低。目前有許多報(bào)道乳酸菌和丙酸桿菌抗真菌活性的研究與應(yīng)用，包括菌株篩選方法的優(yōu)化與創(chuàng)新，發(fā)酵產(chǎn)物中抗真菌成分的前體物質(zhì)的添加以及整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化等。如Garnier等[8]通過(guò)模擬奶酪的方法對(duì)奶酪中具有抗真菌活性的菌株進(jìn)行篩選，文中介紹了24孔板法對(duì)干酪中乳桿菌的篩選及測(cè)定其抗真菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌對(duì)真菌抑制的種類和效果有所差異。實(shí)驗(yàn)所用的幾種干酪乳桿菌的含菌培養(yǎng)物均顯示出抗真菌活性，但抑制的真菌種類和抑制效果不盡相同。；并且Valerio等[9]通過(guò)添加乳酸菌抗真菌代謝物中苯乳酸的前體物質(zhì)苯丙氨酸提高了乳酸菌的抗真菌活性，文中采用96孔板進(jìn)行微孔稀釋試驗(yàn)測(cè)定抗真菌活性，結(jié)果表明，乳酸菌顯示的抗真菌活性可以通過(guò)向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入苯丙酮酸來(lái)改善和優(yōu)化，并且它是存在幾種以協(xié)同方式起作用的代謝物的結(jié)果；Zhang等[10]通過(guò)Lactobacillus buchneri和Lactobacillus diolivorans在酸面團(tuán)中共同發(fā)酵產(chǎn)生丙酸來(lái)達(dá)到抗真菌效果，文中使用瓊脂孔擴(kuò)散評(píng)估乳桿菌發(fā)酵的酸面團(tuán)的抗真菌活性，以期可以通過(guò)添加酸面團(tuán)來(lái)代替化學(xué)品的使用。因此，本文從多株乳酸菌和丙酸桿菌菌株中篩選出抗食品腐敗真菌活性較高菌株[11-12]，通過(guò)一系列方法篩選抗食品腐敗真菌菌株最佳組合[13]，從混合菌發(fā)酵角度出發(fā)，優(yōu)化混合菌發(fā)酵條件以最大限度提升植物乳桿菌L9和費(fèi)氏丙酸桿菌D5菌株組合的抗真菌效果，解決單菌抗真菌活性低、減少市場(chǎng)食品浪費(fèi)問(wèn)題[14-16]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）D4、D5和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis） L1～L6、L8、L9菌株、沃納利葡萄球菌（Staphylococcus warneri）L7 由上海市華東師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） MRE3013、MRE3014、MRE3035菌株 從羅非魚腸道中分離得到，由中國(guó)海洋大學(xué)食品學(xué)院贈(zèng)予；費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichiiATCC 9614） D1、D2 美國(guó)ATCC菌種保藏中心；指示菌 面包腐敗真菌（黑曲霉、黃曲霉、桔青霉、枝孢霉、交鏈孢霉）；MRS培養(yǎng)基、SLB培養(yǎng)基、ME培養(yǎng)基、MESP培養(yǎng)基、TGYE培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PDA培養(yǎng)基 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；M17培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；WFH培養(yǎng)基 20%高筋小麥粉（w/v）在室溫下于磁力攪拌器中1200 r/min攪拌4 h，于冷凍離心機(jī)中離心（4000 r/min，10 min，4 ℃）獲得上清液，每升上清液中加入葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和果糖各15 g，以及10 g酵母浸粉和7 g瓊脂，pH6.8±0.1，106 ℃，滅菌20 min；脫脂乳粉培養(yǎng)基 40 g/L脫脂乳粉，pH7.0±0.1，115 ℃，滅菌30 min。

HCB-900V超凈工作臺(tái) 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；CR22N大容量高速冷凍離心機(jī) Hitachi Koki Holdings Co., Ltd；9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；Synergy HT酶標(biāo)儀BioTek Instruments，Inc.；T18 ULTRA-URRAX均質(zhì)機(jī) 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；IKA lab dancer漩渦振蕩器 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；DELTA 320 pH計(jì) 梅特勒-托利多國(guó)際有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單一抗真菌性強(qiáng)的菌株篩選 首先從L1-L9、D1、D2、D4、D5、MRE3013、MRE3014和MRE303516株菌株中篩選出抗真菌性較強(qiáng)的單一菌株，再進(jìn)行篩選較強(qiáng)抗真菌性的菌株組合。

將各株乳酸菌和丙酸桿菌分別接種到 MRS和SLB液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃的恒溫?fù)u床中，以180 r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行培養(yǎng)2 d，制備種子液。配制MRS瓊脂培養(yǎng)基于24孔板中，用10 μL規(guī)格的一次性接種環(huán)沾取各菌株的種子液，在瓊脂平板中進(jìn)行接種，在無(wú)菌層流空氣將其吹干后，放置在厭氧產(chǎn)氣袋中，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h[17-19]。制備指示霉菌孢子懸液，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)[20]孢子懸液的孢子濃度，并將孢子懸液用無(wú)菌水稀釋到1×105個(gè)孢子/mL，4 ℃冰箱保藏備用。配制軟瓊脂，高壓蒸汽滅菌后在55 ℃水浴鍋中保溫備用。將1×105個(gè)孢子/mL的5種霉菌孢子懸液分別用軟瓊脂10倍稀釋，振蕩搖勻，制備含1×104個(gè)孢子/mL霉菌孢子的軟瓊脂[21]。將5 mL 1×104個(gè)孢子/mL的5種軟瓊脂分別加入到培養(yǎng)48 h的各菌株MRS瓊脂平板中進(jìn)行覆蓋。待軟瓊脂凝固后，將平板放入28 ℃的培養(yǎng)箱中有氧培養(yǎng)，觀察記錄各孔霉菌的生長(zhǎng)情況。

1.2.2 24孔板法篩選復(fù)合菌株協(xié)同抗真菌組合 將各株抗真菌乳酸菌和丙酸桿菌分別接種到 MRS 肉湯和SLB培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下分別培養(yǎng)24和48 h制備種子培養(yǎng)液。將種子培養(yǎng)液離心（5000×g,10 min，4 ℃），并用無(wú)菌生理鹽水重懸振蕩進(jìn)行洗滌，洗滌2次后重懸于十分之一體積的生理鹽水中，將菌懸液稀釋，取樣測(cè)定OD600，緩慢加入生理鹽水稀釋，直到稀釋到OD600=0.5，兩個(gè)菌大小形態(tài)相似，所以對(duì)應(yīng)的OD600也幾乎一樣，以此為比例進(jìn)行稀釋。記錄這個(gè)稀釋濃度，在超凈臺(tái)里以同樣濃度稀釋，兩個(gè)菌都是稀釋到OD600=0.5制備菌懸液。

將制備好的菌懸液各50 μL加入到含乳酸菌和丙酸桿菌混菌瓊脂培養(yǎng)基的24孔板中，設(shè)計(jì)陰性對(duì)照（加入菌懸液100 μL）和陽(yáng)性對(duì)照組（加入無(wú)菌生理鹽水100 μL），然后加入用 1 mL融化的小麥粉水解物（WFH）瓊脂培養(yǎng)基（45 ℃水浴鍋保溫），與之前加入的菌液搖晃混合混勻，待瓊脂凝固后置于 30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h[22]。 培養(yǎng)18 h后，在24孔板各孔中覆蓋100 μL 含104個(gè)指示真菌孢子/mL 的軟瓊脂，28 ℃培養(yǎng)，每24 h觀察乳酸菌/丙酸桿菌組合對(duì)指示霉菌的抑制情況并記錄[23]。

1.2.3 分級(jí)抑菌濃度（Fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）法進(jìn)一步篩選復(fù)合菌協(xié)同抗真菌組合 制備1.2.2步驟中篩選得到的菌株的OD600=0.5的菌懸液進(jìn)一步篩選復(fù)合菌協(xié)同抗真菌作用。將菌液用無(wú)菌的生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，乳酸菌稀釋為10、10-1、10-2、10-3倍原濃度的菌懸液，10、10-1、10-2、10-3、10-4倍原濃度的菌懸液。24孔板為4×6排列的小孔，除了最后一縱列作為空白對(duì)照（100μL無(wú)菌生理鹽水）外，剩下4×5格。將4種梯度濃度的乳酸菌菌懸液從上到下每行濃度依次遞減加入，每孔50 μL；將5種梯度濃度的丙酸桿菌菌懸液從左到右丙酸菌每行濃度依次遞減加入，每孔50 μL，然后加入用1 mL融化的小麥粉水解物（WFH）瓊脂培養(yǎng)基（45℃水浴鍋保溫），與之前加入的菌液搖晃混合混勻，待瓊脂凝固后置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。然后在24孔板各孔中覆蓋100 μL 含104個(gè)指示真菌孢子/mL的軟瓊脂，28 ℃培養(yǎng)，每24 h觀察乳酸菌/丙酸桿菌組合對(duì)指示霉菌的抑制情況并記錄。

1.2.4 混合菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化 在上述的試驗(yàn)中，篩選出了植物乳桿菌L9和費(fèi)氏丙酸桿菌D5作為后續(xù)混合發(fā)酵中的抗真菌菌株組合。因此，我們將對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，以提高協(xié)同抗真菌能力[24]。

1.2.4.1 Plackett-Burman試驗(yàn) 研究發(fā)現(xiàn)有12個(gè)因素對(duì)植物乳桿菌L9和費(fèi)氏丙酸桿菌D5有影響，它們分別是葡萄糖（A）、碳酸鈣（B）、酵母浸粉（C）、酪蛋白胨（D）、磷酸氫二鉀（E）、硫酸鎂（F）、硫酸錳（G）、氯化鈉（H）、接種比（D5:L9）（J）、培養(yǎng)溫度（K）、乙酸鈉（L）、檸檬酸銨（M）[25]。通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)以上12個(gè)因素進(jìn)行研究，每個(gè)因素分別選取兩個(gè)水平：低水平“-1”和高水平“+1”，響應(yīng)值為發(fā)酵液上清液的抗真菌活性。表1列出了因素的編碼及水平，X1～X12分別編碼了12個(gè)因素。

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)表如表1所示，按照設(shè)計(jì)表中的順序配制培養(yǎng)基、調(diào)整接種量和發(fā)酵溫度，發(fā)酵4d后做96孔板試驗(yàn)，用酶標(biāo)儀測(cè)定[26]并計(jì)算發(fā)酵液上清液的抗真菌活性，在表中最右列列出，96孔板操作和抗真菌活性計(jì)算公式如下：

表1 Plackett-Burmen實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平范圍Table 1 Range of different factors investigated of Plackett-Burman design

將制得的無(wú)細(xì)胞上清液加入到96孔板的孔中，每孔添加量為100 μL；將無(wú)菌的ME肉湯以每孔100 μL的量加入到后續(xù)的孔中，對(duì)無(wú)細(xì)胞上清液進(jìn)行連續(xù)的2倍濃度梯度稀釋，獲得一系列的無(wú)細(xì)胞上清液稀釋液（至少3個(gè)平行對(duì)照），以不含無(wú)細(xì)胞上清液的ME肉湯作為陰性對(duì)照；然后在稀釋液中加入100 μL 含1×104個(gè)孢子/mL的霉菌孢子ME肉湯（陽(yáng)性對(duì)照加入無(wú)霉菌孢子肉湯），放入28 ℃的恒溫恒濕（80% RH）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

霉菌生長(zhǎng)受無(wú)細(xì)胞上清液抑制的程度通過(guò)測(cè)定96孔板中霉菌在620 nm波長(zhǎng)處的吸光度確定。細(xì)胞上清液的抗真菌活性以AU為單位定量，其表示為霉菌生長(zhǎng)抑制率為50%的情況下，對(duì)應(yīng)的無(wú)細(xì)胞上清液的濃度的倒數(shù)。其中生長(zhǎng)抑制率（Ifungal）的計(jì)算公式為：

其中，Ifungal為對(duì)霉菌的生長(zhǎng)抑制率；At為實(shí)驗(yàn)組孔中霉菌的吸光度；Apc為陽(yáng)性對(duì)照（無(wú)霉菌生長(zhǎng)）孔的吸光度；Anc為陰性對(duì)照孔中霉菌的吸光度。

通過(guò)線性插值法確定Ifungal=50%時(shí)無(wú)細(xì)胞上清液的濃度（IC50），公式如下：

其中IC50為無(wú)細(xì)胞上清液在Ifungal=50%時(shí)的濃度；C＜50為無(wú)細(xì)胞上清液在Ifungal＜50%孔中的濃度；C＞50為無(wú)細(xì)胞上清液在Ifungal＞50%孔中的濃度；I＞50為無(wú)細(xì)胞上清液在Ifungal＞50%孔中的生長(zhǎng)抑制率；I＜50為無(wú)細(xì)胞上清液在Ifungal＜50%孔中的生長(zhǎng)抑制率；I50=50%。

于是抗真菌活性（Aantifungal）的計(jì)算公式為：

1.2.4.2 最陡爬坡試驗(yàn) 影響植物乳桿菌L9和費(fèi)氏丙酸桿菌D5菌株發(fā)酵液抗真菌活性的三個(gè)關(guān)鍵因素為酵母浸粉（C）、葡萄糖（A）、碳酸鈣（B）；最終得到三個(gè)主要因素的回歸方程：抗真菌活性（AU）=-26.7+0.834A-0.518B+0.268C，從回歸方程中可以看出，葡萄糖（A）和酵母浸粉（C）對(duì)抗真菌活性有正效應(yīng)，碳酸鈣（B）則對(duì)其有負(fù)效應(yīng)。以發(fā)酵液上清液的抗真菌活性作為響應(yīng)值，對(duì)3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Design of the steepest climbing test

1.3 數(shù)據(jù)處理

各項(xiàng)數(shù)據(jù)均平行三次，用Word和Graphpadprism8作圖，通過(guò)Minitab 18軟件進(jìn)行分析，得到試驗(yàn)方差分析表比較組間差異的顯著性，通過(guò)Design Expert 12軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，對(duì)得到的回歸模型進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌菌株對(duì)5種霉菌的抗真菌效果

測(cè)定單菌菌株對(duì)5種霉菌的抗真菌效果，在24孔板中用雙層瓊脂覆蓋法評(píng)估了單菌菌株對(duì)5種霉菌指示菌的抗真菌效果，而桔青霉、黃曲霉是前期所試驗(yàn)面包中污染霉菌出現(xiàn)頻率最高的兩種霉菌，因此篩選主要對(duì)這兩種菌抑制效果較強(qiáng)的抗真菌菌株。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)有6株菌株對(duì)桔青霉、黃曲霉的抑制效果比較明顯，其中L7為沃納利葡萄球菌，L8、L9為乳酸乳球菌，3103、3014、3035為植物乳桿菌。從圖1可以看出，L9菌株和3103菌株對(duì)桔青霉、黃曲霉的抑制效果最強(qiáng)，其次為3035菌株、L8菌株、L7菌株和3014菌株。所有菌株對(duì)5種霉菌的抗真菌效果如表1所示。鑒于L7是不屬于《可用于食品的菌種名單》的菌種，所以后續(xù)試驗(yàn)中不再對(duì)它的抗真菌活性進(jìn)行進(jìn)一步研究。

從圖1和表3中可以看出，在15株抗真菌菌株中，編號(hào)為L(zhǎng)8、L9的乳酸乳球菌和編號(hào)為3103、3014、3035的植物乳桿菌這5株菌株對(duì)面包中污染霉菌出現(xiàn)頻率最高的兩種霉菌桔青霉和黃曲霉有較強(qiáng)的抗真菌效果；丙酸桿菌屬菌株對(duì)霉菌的抑制效果要整體強(qiáng)于乳酸菌組。但乳酸菌中也有個(gè)別對(duì)5種霉菌抑制能力較強(qiáng)的菌株，如L1、L9、3013和3035菌株。而且霉菌對(duì)于抗真菌菌株的敏感性也有差異，在PDA平板中加入不同添加量的發(fā)酵液后，枝孢霉和鏈格孢霉在較低的發(fā)酵液添加量下被抑制，在96孔板試驗(yàn)下，也是在較低的濃度下被抑制，而黑曲霉、黃曲霉和桔青霉在稍高的發(fā)酵液添加量下才被抑制。因此得出黑曲霉、黃曲霉和桔青霉的生長(zhǎng)不容易被抗真菌菌株所抑制，而枝孢霉和交鏈孢霉的生長(zhǎng)較易被抑制。

圖 1 6株菌株對(duì)桔青霉Q05（A）和黃曲霉Y03（B）的抑制效果Fig.1 Inhibitory effects of 6 strains on Penicillium citrinum Q05 (A) and Aspergillus flavus Y03 (B)

表3 各抗真菌菌株對(duì)5種霉菌的抑制效果Table 3 Inhibitory activity of antifungal strains against 5 kinds of molds

2.2 復(fù)合菌協(xié)同作用對(duì)真菌的影響

由前期實(shí)驗(yàn)表明，選擇黃曲霉作為指示菌。對(duì)所有乳酸菌和丙酸桿菌懸液進(jìn)行處理，取樣測(cè)定OD600值，加生理鹽水稀釋，直到稀釋到OD600=0.5，兩個(gè)菌大小形態(tài)相似，所以對(duì)應(yīng)的OD600也幾乎一樣，以此為比例進(jìn)行組合，在所有的組合中有7組結(jié)果相對(duì)較好，如圖2所示。所有乳酸菌和丙酸桿菌菌株組合的測(cè)定結(jié)果如表4所示。

從圖2和表4中可以看出，乳酸菌中植物乳桿菌L9、3014、3035在與丙酸桿菌中D1和D5組合培養(yǎng)后表現(xiàn)出抗真菌活性的增加，表現(xiàn)出了抗真菌活性的協(xié)同作用。而植物乳桿菌L9、3014、3035在第一個(gè)結(jié)果中已被篩選出為單一抗真菌較強(qiáng)菌株，又與丙酸桿菌進(jìn)行組合也被篩選出為抗真菌性較強(qiáng)組合，證明猜想正確。

圖 2 乳酸菌和丙酸桿菌組合對(duì)黃曲霉Y03的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of Lactobacillus and Propionibacterium combination on Aspergillus flavus Y03

表4 乳酸菌和丙酸桿菌的組合對(duì)黃曲霉Y03的抑制效果Table 4 Inhibitory effect of Lactobacillus and Propionibacterium combination on Aspergillus flavus Y03

圖 3 FIC法測(cè)定抗真菌活性Fig.3 Antifungal activity assayed by FIC method

2.3 FIC法探究復(fù)合菌抗真菌組合的協(xié)同作用

從上個(gè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌L9、3014和3035菌株與費(fèi)氏丙酸桿菌D1和D5有較強(qiáng)的抗真菌活性，于是在本實(shí)驗(yàn)中用FIC方法對(duì)這3×2種組合的協(xié)同抗真菌活性進(jìn)行了進(jìn)一步的探究，其結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，在植物乳桿菌L9與費(fèi)氏丙酸桿菌D1和D5的組合中，其抗真菌活性與兩種菌的濃度表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。而在植物乳桿菌3014和3035與費(fèi)氏丙酸桿菌D1的組合中，10-2濃度的植物乳桿菌有著最佳的抗真菌效果，而過(guò)高的植物乳桿菌細(xì)胞濃度減弱了其對(duì)黃曲霉Y03的抑制作用，這可能是費(fèi)氏丙酸桿菌D1與植物乳桿菌之間在過(guò)高濃度有相互抗衡作用， 但在費(fèi)氏丙酸桿菌D1的抗真菌效果上看，最高的細(xì)胞濃度取得了最佳的抗真菌效果。費(fèi)氏丙酸桿菌D5與植物乳桿菌3014和3035的組合的抗真菌效果并不理想，所有細(xì)胞濃度的抗真菌效果大致相當(dāng)。

因此，在對(duì)比這3×2種植物乳桿菌和費(fèi)氏丙酸桿菌混合培養(yǎng)所展現(xiàn)的協(xié)同抗真菌作用后，最終確定植物乳桿菌L9和費(fèi)氏丙酸桿菌D5作為后續(xù)混合發(fā)酵中的抗真菌菌株組合。

2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

本文通過(guò)用Plackett-Burmen試驗(yàn)設(shè)計(jì)從12個(gè)考察因素中快速、有效地篩選出顯著因子，各因素的編碼和水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5，表中的1～23分別代表23組試驗(yàn)，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，每組三次平行樣[27]。

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 5 Plackett-Burman experimental design and results

Plackett-Burman試驗(yàn)的方差分析表如表6所示，從表6中可以看出模型P值為0.03＜0.05，表明多元回歸模型對(duì)結(jié)果的影響顯著。葡萄糖在模型中P值為0.014＜0.05、碳酸鈣在模型中P值為0.02＜0.05，酵母浸粉的P值為0.009＜0.01，表示這三個(gè)因素的水平變化對(duì)植物乳桿菌L9和費(fèi)氏丙酸桿菌D5菌株發(fā)酵液抗真菌活性有顯著的影響，其他因素不顯著。

表6 Plackett-Burman試驗(yàn)的方差分析Table 6 Analysis of variance in Plackett-Burman design

12個(gè)因素的帕累托圖如圖4所示，12個(gè)因素的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)值按照大小依次從上到下排列，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)值大于2.262時(shí)即為顯著[28]。從圖4中可以看出，標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)值大于2.26的三個(gè)因素依次分別為酵母浸粉（C）、葡萄糖（A）和碳酸鈣（B），表明這三個(gè)因素對(duì)植物乳桿菌L9和費(fèi)氏丙酸桿菌D5菌株發(fā)酵液抗真菌活性的影響最大。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)值最小的酪蛋白胨、氯化鈉和硫酸鎂3個(gè)存在與否對(duì)發(fā)酵液抗真菌活性影響較小的培養(yǎng)基成分進(jìn)行舍棄，最終得到的用于進(jìn)行下一步爬坡試驗(yàn)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖40 g/L，碳酸鈣16 g/L，酵母浸粉 10 g/L，磷酸氫二鉀 0.25 g/L，硫酸錳 0.1 g/L，乙酸鈉 5 g/L，檸檬酸銨 2 g/L。接種比例為5:1（D5:L9）、發(fā)酵溫度為37 ℃。

2.5 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

如表2和圖5所示最陡爬坡試驗(yàn)的6個(gè)梯度條件及其發(fā)酵液的抗真菌活性結(jié)果。從中可以看出，隨著葡萄糖和酵母浸粉含量的增加，碳酸鈣含量的減少，發(fā)酵液抗真菌活性呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)，在編號(hào)為4的實(shí)驗(yàn)組條件下（葡萄糖55 g/L、碳酸鈣6.7 g/L和酵母浸粉14.8 g/L）出現(xiàn)最大值，其發(fā)酵液抗真菌活性達(dá)到最大，為47.07 AU。因此，得到優(yōu)化后的三個(gè)關(guān)鍵影響因素的最佳比例為葡萄糖55 g/L、碳酸鈣6.7 g/L和酵母浸粉14.8 g/L。

3 結(jié)論

本文以導(dǎo)致面包發(fā)霉的典型真菌（黑曲霉、黃曲霉、桔青霉、枝孢霉、交鏈孢霉）為指示菌[29]，篩選出了5株對(duì)面包中污染霉菌出現(xiàn)頻率最高的兩種霉菌桔青霉和黃曲霉抑制效果比較明顯的單菌菌株，分別是編號(hào)為L(zhǎng)8、L9的乳酸乳球菌，編號(hào)為3103、3014、3035的植物乳桿菌，并篩選出一組發(fā)酵液具有明顯抗真菌作用的復(fù)合菌株組合植物乳桿菌 L9 和費(fèi)氏丙酸桿菌 D5，對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，選出對(duì)最終抗真菌活性影響最大的三個(gè)因素依次分別為酵母浸粉、葡萄糖和碳酸鈣，發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化配方為葡萄糖55 g/L，碳酸鈣6.7 g/L，酵母浸粉14.8 g/L，磷酸氫二鉀 0.25 g/L，硫酸錳 0.1 g/L，乙酸鈉 5.0 g/L，檸檬酸銨 2.0 g/L，接種比例為5:1（D5:L9），發(fā)酵溫度為37 ℃，抗真菌活性可達(dá)47.07 AU。本論文首次對(duì)乳酸菌和丙酸桿菌協(xié)同抗真菌效果進(jìn)行研究，結(jié)果表明復(fù)合菌發(fā)酵液抗真菌效果明顯，可在食品制作中加入復(fù)合菌發(fā)酵液替代部分水，抑制食品中腐敗霉菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期。