黃蜀葵花總黃酮提取工藝優化及其對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

王 敏，徐國輝，趙一靈，王剛強，朱湘玥，黃贛輝,

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌 330047；2.江西省撫州市檢驗檢測認證中心，江西撫州 344000；3.四川樂山天馬晨達農業有限公司，四川樂山 614500）

黃蜀葵花（Abelmoschus Manihot（L.） Medic.）為錦葵科秋葵屬草本植物黃蜀葵的花朵，原產地為我國南方的山谷草叢、田邊或灌木叢旁，現除西北以及東北等地外，全國大部分地區均有分布[1]。現代研究表明，以金絲桃苷為代表的黃酮類物質是黃蜀葵花的主要功能成分[2]，具有抗癌、抗疲勞、利尿等功效[3-5]。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）是人體內催化黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸的關鍵酶[6]。人體內嘌呤含量過高會代謝產生大量尿酸，進而引發高尿酸血癥，長期高尿酸血癥還可誘發高血壓、糖尿病、腎衰竭等疾病[7]。與一線西藥相比，天然黃酮作為XOD抑制劑，更加安全、廉價。因此，提取黃蜀葵花中黃酮類物質作為保健食品或藥品的原料具有較好的應用前景[8]。

目前，黃蜀葵花總黃酮的提取方法主要有乙醇回流法、超聲波提取法、超臨界提取等。如王鵬等[9]采用乙醇回流提取黃蜀葵花中金絲桃苷；宋健剛等[10]采用超聲波法輔助提取黑果腺肋花楸果中金絲桃苷；劉可福[11]研究了超臨界提取法提取銀杏葉中的有效成分。但這些方法或存在能耗大，或存在提取效率不高等問題[12-14]。十二烷基硫酸鈉（SDS）是一種加入少量就能顯著降低液體表面張力的物質，可增加大分子有機物質的溶解滲出能力，具有良好的增溶效果。國內外已有部分科技工作者利用SDS的增溶作用，進行黃酮成分的提取研究[15-16]。如李嬌等[17]研究了SDS強化柴胡皂苷的提取工藝；張馨心等[18]采用SDS強化超聲波提取龍牙傯木中的齊墩果酸。但超聲SDS輔助醇提取黃蜀葵花總黃酮鮮有報道。此外，黃蜀葵花提取液通常被用來研究其抗氧化、抗癌、抗疲勞等性能，目前還缺乏對其抑制XOD活性的研究。

因此，本文采用超聲SDS輔助提取沐川縣黃蜀葵花中的總黃酮，通過響應面優化設計，得出最佳提取條件；采用XOD體外抑制模型，測定提取液對XOD的抑制作用，為黃蜀葵花開發提供科學的數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃蜀葵花干制品 四川樂山天馬山晨達農業有限公司提供，60 ℃烘干后粉碎過40目篩備用；蘆丁標準品（AR） 上海源葉生物技術有限公司；亞硝酸鈉（AR） 上海同試化工有限公司；無水乙醇（AR）上海振興化工一廠；氫氧化鈉（AR） 西隴化工股份有限公司；十二烷基硫酸鈉 上海譜振生物科技有限公司；九水合硝酸鋁（AR） 鄭州派尼化學試劑廠。

FW-200高速萬能粉碎機 永康市速鋒工貿有限公司；SHZ-Ⅲ循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；KQ-2200DP超聲波清洗器 昆山市超聲清洗儀器有限公司；722N紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮提取工藝 黃蜀葵花→粉碎、過篩（40目）→SDS協同超聲波強化提取→抽濾→減壓濃縮→離心（4000 r /min）→上清液定容→測定吸光度→計算總黃酮含量

操作要點：將粉碎好的粉末分級過篩以保證粉末大小的均一性，直至得到40目的黃蜀葵花粉末。準確稱取2.50 g該粉末于錐形瓶中，并加入70%乙醇溶液和適量SDS，經攪拌均勻后進行超聲提取。抽濾時，應盡量使待過濾物質處于布氏漏斗中央，防止其未經過濾，直接通過漏斗和濾紙之間的縫隙流下。將抽濾所得濃縮液用60%乙醇定容至50 mL容量瓶中，再用移液槍吸取5 mL樣液于25 mL容量瓶中測定總黃酮含量。

1.2.2 單因素實驗 以總黃酮含量為指標，依次改變料液比、超聲波功率、十二烷基硫酸鈉（SDS）濃度、提取溫度和提取時間。確定黃蜀葵花總黃酮提取的最適范圍，計算總黃酮含量[12,19]。單因素實驗設計如下：

1.2.2.1 不同料液比對總黃酮含量的影響 設置料液比1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL，超聲波功率320 W，SDS濃度為0.04 g/mL，提取溫度50 ℃，提取時間50 min提取黃蜀葵花中總黃酮。將提取液抽濾、減壓濃縮、離心（4000 r/min）后，用60%乙醇定容到50 mL容量瓶中。用移液槍吸取5 mL樣液于25 mL容量瓶中，計算總黃酮含量。

1.2.2.2 不同超聲波功率對總黃酮含量的影響 設置超聲波功率240、280、320、360、400 W，料液比1:40 g/mL，SDS濃度為0.04 g/mL，提取溫度50 ℃，提取時間50 min提取黃蜀葵花中總黃酮，計算總黃酮含量。

1.2.2.3 不同SDS濃度對總黃酮含量的影響 設置SDS濃度為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/mL，料液比1:40 g/mL，超聲波功率320 W，提取溫度50 ℃，提取時間50 min提取黃蜀葵花中總黃酮，計算總黃酮含量。

1.2.2.4 不同提取溫度對總黃酮含量的影響 設置提取溫度30、40、50、60、70 ℃，料液比1:40 g/mL，超聲波功率320 W，SDS濃度為0.04 g/mL，提取時間50 min提取黃蜀葵花中總黃酮，計算總黃酮含量。

1.2.2.5 不同提取時間對總黃酮含量的影響 設置提取時間30、40、50、60、70 min，料液比1:40 g/mL，超聲波功率320 W，SDS濃度為0.04 g/mL，提取溫度50 ℃提取黃蜀葵花中總黃酮，計算總黃酮含量。

1.2.3 響應面優化黃蜀葵花總黃酮的提取工藝 依據單因素實驗結果，固定提取溫度60 ℃，提取時間60 min，選取料液比、超聲波功率、SDS濃度3個因素為自變量（分別用A、B、C表示），以黃蜀葵花總黃酮含量為評價指標進行分析，根據中心組合（Box-Behnken）試驗設計原理，采用三因素三水平的響應面分析方法設計實驗，因素與水平編碼表見表1[20-25]。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Response surface test factor level design

1.2.4 標準曲線繪制 精確稱量蘆丁標準品12 mg，60%乙醇溶解后定容于50 mL容量瓶，搖勻備用。用移液槍精確吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL標準溶液，分別置于25 mL容量瓶中，加水至5 mL，分別加入1.0 mL 5% NaNO2溶液，搖勻靜置6 min；加入1.0 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻靜置6 min；加入10.0 mL 10% NaOH溶液；最后用60%乙醇定容至刻度，搖勻放置15 min，510 nm處進行吸光度測定[26]。以吸光度（A）作為縱坐標，蘆丁的質量濃度（C，mg/mL）作為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程A=2.4693C-0.0071，R2=0.99932。

1.2.5 總黃酮含量的測定和計算 用移液槍吸取5 mL不同條件下所得的樣液于25 mL容量瓶中，參照繪制標準曲線的步驟測定吸光度，結合標準曲線方程和公式（1），即可得到總黃酮含量[16]。

式中：V—提取液的體積，mL；C—總黃酮測定樣品溶液濃度，mg/mL；X—總黃酮提取液稀釋的總倍數；M—每次提取加入的樣品質量，g。

1.2.6 總黃酮對XOD的抑制作用 參照Yan等[8]的方法，并作適當修改。將稀釋后的不同濃度梯度的黃蜀葵花提取液與黃嘌呤（2 mmol/L）和XOD（50 μL，0.5 U/mL）進行混合。孵育10 min后加入NaOH（100 μL，1.0 mol/L）終止反應。利用紫外分光光度計在295 nm處測定吸光值。抑制率為計算公式（2）:

式中：A1—空白體系；A2—樣品組。

1.3 數據處理

根據Design-Expert 8.0.6軟件，設計響應面試驗方案、建立數學模型并進行多元回歸分析，選擇最佳提取工藝參數，并使用SPSS軟件對實驗數據進行ANOVA方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對總黃酮含量影響 料液比對黃蜀葵花總黃酮含量的影響見圖1，考察料液比范圍為1:20～1:60 g/mL，結果表明，料液比對黃酮含量的影響較顯著（P＜0.05）。當料液比低于1:50 g/mL時，隨著料液比的增大，總黃酮含量不斷增加。這是因為料液比增加使得溶液與黃蜀葵花接觸面積增大，黃酮類物質溶解更加充分[27]。而當料液比大于1:50 g/mL時，隨著料液比的增大，總黃酮含量反而下降。這是因為料液比過高時溶液中微粒樣品受到超聲波的熱效應和空化作用會減弱[28]。因此，料液比選擇1:50 g/mL為宜。

圖 1 料液比對總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on the content of total flavonoids

圖 2 超聲波功率對總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the content of total flavonoids

2.1.2 超聲波功率對總黃酮含量的影響 超聲波功率對黃蜀葵花總黃酮含量的影響見圖2，考察超聲波功率范圍為240～400 W，結果表明，超聲波功率對總黃酮含量有影響，且不同小寫字母間表示影響極顯著（P＜0.01）。隨著超聲波功率的增大，總黃酮含量呈先上升后下降的趨勢。當超聲波功率為320 W時，總黃酮含量達到最大，因此選擇最佳的提取功率為320 W。總黃酮含量隨超聲波功率增加先升高后降低，原因可能是由于超聲波功率增加，超聲所產生的機械振動作用導致植物組織細胞破碎越來越完全，故總黃酮含量隨著超聲波功率的增加而升高，但是，超聲波功率過大時，因熱效應和空化效應，破壞了黃蜀葵花總黃酮的結構，造成含量下降[14]。

2.1.3 SDS濃度對總黃酮含量的影響 SDS濃度對黃蜀葵花總黃酮含量的影響見圖3，考察SDS濃度范圍為0.02～0.06 g/mL，結果表明，SDS濃度對黃酮含量有影響，且不同小寫字母間表示影響極顯著（P＜0.01）。當SDS濃度小于0.05 g/mL，總黃酮含量隨SDS濃度增大而增加，其原因可能是SDS濃度太小未達到臨界膠束濃度[12]，造成提取不完全。當SDS濃度大于0.05 g/mL時，總黃酮含量隨SDS濃度增大反而減小，原因可能是過量的SDS產生較粗大的乳液泡沫，對提取及過濾操作產生了反作用[29]。因此SDS濃度選取0.05 g/mL為宜。

圖 3 SDS濃度對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of SDS concentration on the content of total flavonoids

2.1.4 提取溫度對總黃酮含量的影響 提取溫度對黃蜀葵花總黃酮含量的影響見圖4，在30～70 ℃的升溫考察過程中，提取溫度為40 ℃時黃酮含量變化較大，大于40 ℃時曲線總體比較平緩，說明提取溫度對黃酮含量的影響不明顯。當提取溫度低于50 ℃時，隨溫度升高總黃酮含量增加較快，這可能是因為高溫使溶劑粘度降低，分子運動加快，從而加快黃酮類物質的溶出[15]。在提取溫度50～60 ℃時，隨溫度升高總黃酮含量緩慢增加，當提取溫度高于60 ℃時，隨溫度升高總黃酮含量反而有下降的趨勢，原因可能是溫度過高使得黃酮類化合物氧化，破壞了黃酮類化合物結構[16]。因此選擇60 ℃為最適溫度。

圖 4 提取溫度對總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the content of total flavonoids

2.1.5 提取時間對總黃酮含量的影響 提取時間對黃蜀葵花總黃酮含量的影響見圖5，考察時間為30～70 min，提取時間為40 min時黃酮含量變化較大，大于40 min時曲線總體比較平緩，說明提取時間對黃酮含量的影響不顯著。當提取時間小于60 min時，隨著提取時間的增加總黃酮含量不斷增大。當提取時間大于60 min時，總黃酮含量略有下降。原因可能是，過長的超聲波時間會導致部分黃蜀葵花黃酮發生氧化作用，因損耗致使總黃酮含量略有下降[15]。因此，選擇60 min作為最佳提取時間。

圖 5 提取時間對黃酮含量的影響Fig.5 Effect of extraction time on the content of total flavonoids

2.2 響應面法優化黃蜀葵花總黃酮的提取條件

2.2.1 模型組合設計及方差分析 響應面的試驗方案及結果見表2，方差分析結果見表3。采用軟件Design-Expert 8.0.6進行多元回歸擬合，得到總黃酮含量（Y）對各項因素的二次多項回歸方程為：Y=4.58-0.087A+0.048B-0.12C+0.026AB+0.15AC+0.22BC-0.33A2-0.21B2-0.35C2。方程的模型顯著性P＜0.05，說明模型具有意義；失擬項P＞0.05，說明失擬項差異不顯著，試驗無失擬因素存在。模型調整系數R2Adj=0.8935，決定系數R2=0.9534，響應值的變化有95.34%來源于所選因素，模型與試驗擬合程度好，試驗誤差較小。因此，該模型對黃蜀葵花總黃酮的提取工藝是有意義的。由方差分析F值可知，對黃蜀葵花總黃酮含量影響因素的主次順序為SDS濃度（C）＞料液比（A）＞超聲波功率（B）。其中C、AC對總黃酮含量的影響顯著（P＜0.05），BC、A2、B2、C2對總黃酮含量的影響極顯著（P＜0.01），A、B、AB對總黃酮含量的影響不顯著（P＞0.05）。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface test design and results

表3 響應面試驗方差分析結果Table 3 Variance analysis of response surface test

2.2.2 交互作用分析 料液比和超聲功率響應面及等高線見圖6（A）和圖6（B）。由圖6（A）和圖6（B）可知，料液比曲面比超聲功率曲面坡度陡峭，即固定其他因素不變，改變料液比對黃蜀葵花總黃酮含量影響較超聲功率大；料液比和超聲功率等高線接近于圓形，表明兩因素的交互作用不顯著[30]。料液比和SDS濃度響應面及等高線見圖6（C）和圖6（D）。由圖6（C）和圖6（D）圖可知，SDS濃度曲面比料液比曲面坡度陡峭，即固定其他因素不變，改變SDS濃度對黃蜀葵花總黃酮含量影響較料液比大；料液比和SDS濃度等高線圖于橢圓，且橢圓與兩軸之間略有角度，表明兩因素的交互作用顯著[30]。超聲功率和SDS濃度響應面及等高線見圖6（E）和圖6（F）。由圖6（E）和圖6（F）可知，SDS濃度曲面比超聲功率曲面坡度陡峭，即固定其他因素不變，改變SDS濃度對黃蜀葵花總黃酮含量影響較超聲功率大；超聲功率和SDS濃度等高線圖趨于橢圓，且橢圓與兩軸之間夾角較大，表明兩因素的交互作用極顯著[30]。以上結果與回歸方程及方差分析結果一致。

圖 6 各因素對黃蜀葵花總黃酮的響應面三維圖和等高線圖Fig.6 Response surface plots showing influences of variables on the total flavonoid yield of Abelmoschus manihot

2.2.3 提取工藝條件的驗證 采用響應曲面分析可得黃蜀葵花總黃酮最優提取條件：料液比1:48.16 g/mL，超聲波功率319.51 W，SDS濃度0.05 g/mL，預測值為4.60 mg/g。將提取條件調整為：料液比1:48 g/mL，超聲波功率320 W，SDS濃度0.05 g/mL。根據調整后的提取條件，進行5次驗證試驗，得出總黃酮含量為4.63 mg/g。

2.3 總黃酮對XOD的抑制作用

黃蜀葵花總黃酮提取液在稀釋一定倍數后，與相同濃度下的SDS對照，所得提取液對XOD的抑制效果如圖7所示。由圖7可知，當抑制劑濃度為0.38～1.92 mg/mL時，總黃酮提取液對XOD的抑制作用明顯大于僅含SDS的空白溶液，且隨著抑制劑濃度的增加，總黃酮的抑制能力逐漸趨于平緩，最大抑制率可達98.35%。該實驗結果可以推測出，黃蜀葵花中的黃酮類物質具有良好的抑制XOD活性的作用。

圖 7 不同抑制劑濃度對XOD的抑制效果Fig.7 Inhibition effect of different inhibitors concentration on XOD

3 結論

本實驗以SDS協同超聲波提取黃蜀葵花總黃酮，在單因素基礎上，用響應面分析法對其提取工藝參數進行優化。確定黃蜀葵花總黃酮的最佳提取工藝條件為：料液比1:48 g/mL，超聲波功率320 W，SDS濃度0.05 g/mL。在此條件下對黃蜀葵花中總黃酮進行提取，含量為4.63 mg/g。SDS是一種陰離子表面活性劑，能使溶液的表面張力顯著降低，對物料具有界面吸附和分散作用，可以增強溶劑對物料的潤濕性和滲透性，加之超聲波的空化作用、機械效應和熱效應，從而增加了黃酮的溶出、提高了提取率、降低了提取時間，該方法操作簡單可行，為黃蜀葵花總黃酮提取提供了一定的參考價值。此外，應用XOD體外抑制模型，總黃酮提取液對XOD的抑制率高達98.35%，由此可推測黃蜀葵花總黃酮具有良好的抑制XOD活性的作用，這為后期研究具體有效成分作為緩解高尿酸血癥的膳食來源提供了理論基礎。