江西產腐乳生物胺水平調查及產胺菌的分離與鑒定

王維亞，黃瑞鈺，駱 瑜，吳珊珊，劉玉婷，李金林

（1.南昌市檢驗檢測中心，南昌市食品安全檢測與控制重點實驗室，江西南昌 330012；2.江西師范大學生命科學學院，江西南昌 330022）

腐乳是我國傳統發酵豆制品，因其質地細膩、口感香醇、味道鮮美，是一種不可多得的佐餐佳品，同時含有人體所需要的多種微量元素，被稱為“東方奶酪”[1]。研究表明，腐乳具有抗氧化、降膽固醇、降血壓[2-3]等多種生理功能，且經過發酵之后，更容易被人體消化吸收。發酵食品中的微生物諸如芽孢桿菌屬（Bacillus）、梭菌屬（Clostridium）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）均能產生脫羧酶[4-5]，使食品中的氨基酸脫羧產生生物胺。生物胺本身在機體中發揮多種生理功能，是正常的活性物質[6]，但是當質量濃度過高身體就會出現偏頭痛、胃部痙攣、嘔吐、腹瀉、過敏等中毒癥狀[7]，其中毒性最大的是組胺和酪胺[8]。調查發現，腐乳、醬油、蝦醬和干腌魚等發酵食品中生物胺水平較高[9-10]。腐乳中豐富的游離氨基酸在微生物的作用下容易脫羧生成生物胺[11]，并發生生物胺積累現象，且不同類型腐乳中生物胺的種類和含量存在明顯差別[12]，腐乳中常見的生物胺有6種：色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺和酪胺[13]。

江西生產腐乳的歷史悠久，但氣候溫濕，適合微生物繁殖，對腐乳食用安全產生不利影響。因此，本文采用高效液相色譜法對江西產腐乳生物胺含量水平進行調查分析，同時采用表型鑒定和基因型16S rDNA測序技術從產胺量較高的腐乳中分離鑒定具有產生物胺能力的菌株，從而對其食用安全性評價提供理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

12種市售腐乳 產地均為江西，樣品具體信息見表1；色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚胺、酪胺、亞精胺、精胺、1,7-二氨基庚烷、丹磺酰氯 純度≥97%，壇墨質檢標準物質中心；乙腈、丙酮 色譜純，默克股份兩合公司；L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、谷氨酸鈉、5′-磷酸吡多醛、碳酸鈣、溴甲酚紫（分析純）、乙酸、乙酸銨（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；三氯乙酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、乙醚 分析純，西隴化工股份有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、dNTP、PCR引物 上海生工生物工程有限公司；DreamTaq-TM DNA Polymerase MBI Fermentas公司；胰酪大豆胨瓊脂（Trypticase Soy Agar，TSA）培養基、胰酪大豆胨液體（Trypticase Soy Broth，TSB）培養基、胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉 北京陸橋股份有限公司。

1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Rotanta 460醫用冷凍離心機 德高Hettich公司；DM1000顯微鏡 德國Leica公司；MJ-150-I生化培養箱上海一恒科學儀器有限公司；HVA-85高溫蒸汽滅菌器 日本HIRAYAMA制造公司；Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR儀 美國Thermo Fisher公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；GenoSens 1880型凝膠成像儀 上海勤翔科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 腐乳生物胺含量測定

1.2.1.1 生物胺標準溶液的配制 參照國標GB 5009.208-2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》第一法高效液相色譜法，配制生物胺的標準溶液和內標溶液，標準溶液濃度為1.0～50.0 mg/L。

1.2.1.2 樣品的提取和衍生 生物胺的提取和衍生參考GB 5009.208-2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》和李大偉等[12]的方法有所改進。取5 g腐乳于25 mL離心管中，加入內標溶液，加入10 mL 50 mg/mL三氯乙酸溶液振蕩提取30 min，4 ℃環境下6000 r/min離心10 min，轉移上清液至25 mL容量瓶中，殘渣用10 mL 50 mg/mL三氯乙酸溶液再提取1次，合并上清液并定容至刻度。

取0.5 mL上述溶液于15 mL離心管中，依次加入200 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液、300 μL飽和碳酸氫鈉溶液、1 mL 10 mg/mL丹磺酰氯溶液（溶劑為丙酮），渦旋數秒后置于60 ℃恒溫水浴鍋中衍生30 min，隔15 min振蕩1次。取出，加入100 μL 50 mg/mL谷氨酸鈉溶液（溶劑為飽和碳酸氫鈉溶液），混勻后60 ℃恒溫反應15 min。取出，冷卻至室溫，加入0.3 g氯化鈉渦旋數秒，加入5 mL乙醚，振蕩后靜置分層，轉移上層有機相（乙醚層）于15 mL離心管中，水相（下層）再萃取1次，合并2次乙醚萃取液，40 ℃水浴下氮氣吹干。加入1 mL乙腈振蕩混勻，使殘留物溶解，0.22 μm 濾膜針頭濾器過濾，待測定。標準溶液同法衍生。

1.2.1.3 高效液相色譜條件 色譜柱為Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），紫外檢測波長254 nm，進樣量20 μL，柱溫35 ℃，流動相 A 為乙腈，流動相 B為含體積分數為0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液，流速0.8 mL/min，梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedures

1.2.2 產生物胺菌株的篩選

1.2.2.1 培養基配制 參考文獻的方法稍作調整配制如下培養基[14-16]。

生物胺初篩培養基（g/L）：胰蛋白胨5.0、酵母浸粉5.0、氯化鈉5.0、碳酸鈣1.0、溴甲酚紫0.06、瓊脂20、前體氨基酸（L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸）各2.0、蒸餾水，pH 5.1～5.5，121 ℃高壓滅菌15 min。

氨基酸TSB培養基（g/L）：TSB 30、5′-磷酸吡多醛0.05、前體氨基酸（L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸）各1.0、蒸餾水，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.2.2 產胺菌的分離純化 取10 g腐乳于90 mL生理鹽水中，充分勻質，制成1:10的樣品懸液，取1 mL樣品懸液以10倍梯度制成1:100和1:1000梯度濃度。各質量濃度懸液吸取100 μL樣液分別涂布到生物胺初篩培養基上，36 ℃培養48 h。挑取平板上不同形態的藍紫色菌落，在初篩培養基上多次劃線分離，觀察菌落形態特征，并接種至TSA平板上保存。

1.2.2.3 產胺菌的復篩 將上述純化后的菌株接種于TSB液體培養基中，36 ℃培養24 h，取0.5 mL菌懸液至氨基酸TSB培養基中，36 ℃，160 r/min搖床培養72 h，取1 mL培養液，加入1 mL 50 mg/mL三氯乙酸溶液，振蕩數秒，4 ℃環境下12000 r/min離心10 min，取0.5 mL上清液按1.2.1.2小節中樣品處理方法測定生物胺含量。

1.2.3 產生物胺菌株的鑒定

1.2.3.1 產胺菌的形態學觀察 觀察菌株在TSA平板上的菌落形態，挑取單菌落進行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察其大小、顏色、形狀等特征。

1.2.3.2 產胺菌的分子生物學鑒定 總DNA的提取：按照Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒說明書上的方法進行。

PCR擴增：采用細菌 16S rDNA 基因的通用引物，正向引物為 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG -3'，反向引物為 1492R：5'-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3'；熱循環參數：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，循環30次后，72 ℃延伸10 min；將擴增產物進行電泳檢測，目標物送至南昌科暢生物科技有限公司測序。

1.3 數據處理

實驗重復3次，結果表示為“平均值±標準偏差”。采用SPSS Statistics V 19.0對實驗數據進行統計分析，顯著性水平設定為0.05。

2 結果與分析

2.1 生物胺的含量測定

2.1.1 生物胺標曲和圖譜 由圖1～圖2可以看出，標準品和樣品中的9種生物胺和內標在32 min內得到較好分離，各生物胺的回歸方程及相關系數如表3所示。結果表明，9種生物胺標準品，在1.0～50.0 mg/L范圍內線性關系良好（r＞0.998），說明用該方法來測定生物胺具有良好的可靠性。

表3 生物胺的保留時間、回歸方程和相關系數Table 3 Retention time, the regression equations and correlation coefficients of biogenic amines

圖 1 生物胺混合標準品溶液的液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of biogenic amines standards

圖 2 腐乳中生物胺的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of biogenic amines in sufu

2.1.2 腐乳樣品中生物胺的含量水平 12種江西產腐乳的生物胺含量如表4所示，不同品牌的腐乳和同一品牌不同系列腐乳的生物胺含量存在顯著性差異（P＜0.05），這可能與添加的輔料混合物的種類、發酵菌種、儲存條件、加工工藝條件和加工環境有關[17-18]。樣品中共檢測到7種生物胺，其中色胺、腐胺、組胺和酪胺是主要生物胺，所有樣品中均檢測到腐胺和酪胺，且這2種生物胺平均含量較高，此結果與劉振鋒[19]的研究相符。12種腐乳中均未檢測到章魚胺和亞精胺。本次調查的腐乳樣品中總生物胺含量范圍為68.5～1084.0 mg/kg，其中2A、3A和12E 3個樣品總生物胺含量均超過1000 mg/kg。文獻[20-21]報道食品中的總生物胺含量超過1000 mg/kg對健康有風險，其中，毒性最大的組胺，在食品中允許的最大含量為50～100 mg/kg[22]，當組胺攝入量為8～40、40～100和高于100 mg時分別可能引起輕度、中度和重度中毒[23]。此次調查中1、11E和12E 3個樣品組胺含量均超過90 mg/kg，接近100 mg/kg的限值。食用發酵豆制品的國家主要集中在亞洲，然而亞洲各國對發酵豆制品中的生物胺含量沒有統一的標準。因此，了解發酵豆制品中的生物胺含量能夠規范發酵豆制品市場，提高發酵豆制品的安全性，為制定其相應的生物胺標準提供數據依據。

表4 腐乳樣品中生物胺含量 （mg/kg）Table 4 Contents of biogenic amines in sufu samples (mg/kg)

2.2 腐乳中產胺菌的分離鑒定

2.2.1 產胺菌的分離純化 生物胺初篩培養基原理是基于培養基中含有多種氨基酸前體和溴甲酚紫顯色劑，如果細菌能夠將這些前體氨基酸脫羧即可生成堿性生物胺，而溴甲酚紫在堿性環境下顯紫色，根據顏色變化即可分離出疑似生物胺產生菌[24]。挑取藍紫色菌落劃線接種于TSA培養基上純化培養，從4種（2A、3A、5B、12E）生物胺含量較高的腐乳中初步分離篩選到12株單菌落。

2.2.2 產胺菌產胺能力的液相測定結果 經高效液相色譜確認，12株菌中有3株不產生物胺，其余9株產胺菌編號為F1～F9，其產胺情況如表5所示。每株菌能產2～3種生物胺，F2、F3、F5、F6、F8和F9的產胺能力較強，總生物胺含量范圍為93.8～369.2 mg/L。其中，F2產苯乙胺、腐胺和酪胺能力最強，分別80.1、

表5 菌株的生物胺生成情況 （mg/L）Table 5 Biogenic amine contents produced by strains (mg/L)

66.4和22 2.7 mg/L；F5、F8和F9均產色胺、腐胺和組胺，生物胺總量無顯著差異（P＞0.05）；F6的色胺產生能力最強，為85.3 mg/L。雖然生物胺的積累可能與不同種的微生物有關，但也有研究報道相較于微生物的種類來說，其細菌菌株本身對于生物胺的形成有更大的影響，這可能是由于不同菌株的產氨基酸脫羧酶能力不同[25]。

2.2.3 產胺菌的形態學鑒定 選擇產胺量較高的6株菌，觀察在TSA平板上的形態并進行革蘭氏染色，結果如表6所示，結果表明，F3是革蘭氏陽性桿菌、F6是革蘭氏陽性葡萄球菌，其余都是革蘭氏陽性芽孢桿菌。對革蘭氏陽性桿菌、革蘭氏陽性葡萄球菌、革蘭氏陽性芽孢桿菌進行顯微鏡下觀察菌落特征，結果如圖3所示，從圖3可以看出，革蘭氏陽性桿菌呈正圓柱形，菌體大多平直，亦有稍彎曲的，排列分散存在，無一定排列形式，偶有成對或鏈狀。革蘭氏陽性芽孢桿菌呈圓形或卵圓形，單生或形成短鏈，有的直徑大于菌體，使菌體膨大呈梭狀，革蘭氏陽性葡萄球菌形態為圓形，排列成葡萄串狀。

表6 菌株的形態學鑒定Table 6 Morphological identification of strains

2.2.4 產胺菌的分子生物學鑒定 對6株高產生物胺菌株進行16S rDNA序列測定，PCR產物電泳圖譜如圖4所示，在1400 bp左右出現了清晰明亮的擴增條帶，說明PCR擴增成功。

圖 3 菌株的革蘭氏染色Fig.3 Gram staining of strains F3、F5 and F6

圖 4 PCR產物電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR products

將上述的測序結果在NCBI-Blast數據庫比對，其結果如表7所示。

表7 16S rDNA 序列 Blast 比對Table 7 Blast analysis of 16S rDNA sequences

胡鵬[26]介紹食品中生物胺的主要制造者是食品中的微生物，主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、克雷白氏桿菌屬（Klebsiella Trevisan）、變形桿菌屬（Proteus）、沙門氏菌屬（Salmonella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、微球菌屬（Micrococcus cohn）等。本實驗得到的6株高產生物胺菌株中有4株為芽孢桿菌屬，其中F5、F8和F9同為耐硼賴氨酸芽孢桿菌，且分別來自不同品牌腐乳，其產胺種類和產胺能力相近，魯梅利桿菌和皮脂葡萄球菌的產胺特性還鮮有報道。研究表明，原料中產生物胺微生物的種類和數量與其產品中生物胺含量密切相關[27]，可通過調節溫度、鹽度及pH，抑制菌株生長活性，減少氨基酸脫羧酶表達，降低生物胺含量[28-29]。對于本實驗分離鑒定出的產胺菌，明確影響其生長及產生物胺能力的理化因素，采取針對性措施降低腐乳中生物胺含量，是后續研究的方向。

傳統發酵豆制品發酵過程中雖然有優勢菌群起主導作用，但由于自然發酵、特殊的多工序、開放式或半開放式生產方式，實際上傳統發酵豆制品生產是一個多菌種混菌發酵過程，微生物主要來自于曲種和環境[30]。腐乳中豐富的游離氨基酸和多菌種混菌發酵過程決定其高水平生物胺含量。可通過對加工過程制定良好操作規范，減少環境微生物，改進加工工藝，抑制產胺菌的活性來控制生物胺的產生，提高產品質量和食用安全性。

3 結論

本研究的江西產腐乳樣品中檢測的生物胺含量范圍為68.5～1084.0 mg/kg，其中2A、3A和12E 3個樣品生物胺含量超過建議的1000 mg/kg限值。共檢測出7種生物胺，所有腐乳樣品腐胺和酪胺平均含量最高，不同品牌的腐乳和同一品牌不同系列的腐乳其生物胺含量存在顯著性差異（P＜0.05）。運用生物胺顯色培養基初篩、高效液相色譜確認結合16S rDNA測序技術分離鑒定出6株高產生物胺的菌株，耐熱芽孢桿菌（Bacillus sporothermodurans）1株，魯梅利桿菌（Rummeliibacillus stabekisii）1株，耐硼賴氨酸芽孢桿菌（Lysinacillus boronitolerans）3株和皮脂葡萄球菌（Staphylococcus piscifermentans）1株。本研究為發酵豆制品中生物胺限量標準的制定以及進一步探清如何抑制腐乳中產胺菌的活性提供了理論研究基礎。