QuEChERS前處理結合超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測茶葉中14種農藥殘留

朱穎潔，曹燕卿，毛 劼，張 康，董方霆，何 昆，王 娜

（國家生物醫學分析中心，北京 100850）

我國是茶葉的發源地，也是茶葉生產和消費量最大的國家。由于茶樹生長喜溫暖潮濕環境、種植單一化、缺乏生物多樣性的特點，較易發生病蟲害，其規模化種植過程中離不開農藥的使用，農藥殘留問題難以避免[1-2]。國家允許在茶葉上使用一些高效低毒的農藥，在GB 2763-2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》中規定了106項茶葉農藥殘留限量標準[3]。然而，由于部分商家追求利益盲目施加農藥和化肥催生、茶農使用農藥不科學等原因，食品安全監督檢查中茶葉農殘超標的情況時有發生，甚至屢有禁用高毒農藥的檢出，嚴重危害消費者安全與市場信心[4-5]。

近年來，農藥殘留分析方法向著快速、簡單、靈敏、低成本、易普及的方向發展。液相色譜-串聯質譜法和氣相色譜-串聯質譜法是最常用的農藥多殘留檢測分析手段，具有高靈敏度、高通量、定量準確等優點[6-9]。由于茶葉樣品基質復雜，含有大量的茶多酚、生物堿、色素和有機酸等物質，檢測過程中會產生較強的基質效應，必須通過前處理凈化以減弱對目標農藥檢測的影響[10-11]。茶葉農藥殘留檢測中傳統的樣品前處理技術如固相萃取[12-13]、液液萃取[14]、基質固相分散萃取[15]等常需要多次凈化步驟，操作較為繁瑣和耗時。2003年美國農業部Anastasiadis等發布的QuEChERS法[16]，是液液萃取法與基質分散固相萃取法相結合形成的一種前處理方法，通常使用乙腈或含1%乙酸的乙腈提取，加入無水硫酸鎂（MgSO4）、氯化鈉（NaCl）除水，配合使用N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）和十八烷基硅烷（C18）等進一步凈化，對不同種類的農藥均有較好的回收率，具有操作簡單、快速高效、成本低廉的優點[17]，在果蔬[18-20]、食用菌[21]、中藥材[22]等植物源食品的多農殘檢測中得到了廣泛的應用。本研究的主要目的是開發一種基于QuEChERS前處理技術結合UPLC-MS/MS，同時檢測茶葉中14種常見農藥殘留的高靈敏、快速檢測方法，考察提取液組分、QuEChERS凈化柱等對回收率的影響，確定了最優條件，并將方法應用于30種市售茶葉樣品檢測，以期為高效和準確地評價茶葉的質量安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

14種農藥標準品（啶蟲脒、涕滅威、克百威、內吸磷、滅線磷、吡蟲啉、茚蟲威、甲胺磷、滅多威、氧化樂果、甲基對硫磷、硫環磷、丙溴磷、噻蟲嗪）（100 mg/L） 天津阿爾塔科技有限公司，于-20 ℃冰箱保存；30種茶葉包括不同種類綠茶（獅峰龍井、竹葉青、采花毛尖、西湖龍井、太平猴魁茶、桐城小花、綠楊春、清明茶高山綠）、紅茶（武夷山紅茶、祁門紅茶、生態野生紅茶、古樹紅茶、金駿眉）、白茶（牡丹王白茶、政和白茶、安吉白茶）、烏龍茶（鐵觀音、大紅袍、老樅水仙、馬頭巖肉桂）、花茶（茉莉花茶、菊花茶、蒲公英玫瑰茶、玫瑰花茶）、普洱茶、青稞茶、刺五加茶等 購于當地超市和茶葉專賣店，西湖龍井和古樹紅茶按照《GB 23200.121-2021》所示LC-MS/MS方法檢測未檢出本研究涉及的14種農藥，分別作為空白綠茶和紅茶基質進行相關研究；QuEChERS鹽包（含有6 g MgSO4，1.5 g乙酸鈉） 北京綠綿科技有限公司；尼龍微孔濾膜（型號SHIMEN DISC，孔徑0.22 μm） 日本SHIMADZU公司；乙腈、甲醇、甲酸 色譜純，美國Fisher公司；甲酸銨、乙酸 分析純，德國Merk公司；4種QuEChERS凈化柱及其使用方法如表1所示。

圖 1 14種農藥的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram （TIC） of 14 pesticides

Q-Trap 6500質譜儀 美國AB Sciex公司；LC-30AD液相色譜儀 日本SHIMADZU公司；Centrifuge 5810R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；QL-901渦旋儀 美國KYLIN-BELL LAB公司；破壁粉碎機 中國天喜公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 提取：稱取1 g粉碎好的茶葉樣品于50 mL離心管中，加入10 mL超純水，渦旋振蕩5 min，加入10 mL 1%乙酸-乙腈溶液，渦旋振蕩30 s，加入QuEChERS鹽包，渦旋振蕩5 min，以9000 r/min離心5 min，得上清提取液。

凈化：經過上述得到的上清液分別使用4種QuEChERS凈化柱進行下一步凈化處理，具體方法見表1。

表1 4種QuEChERS凈化柱型號、成分及使用方法Table 1 Model, component and usage of four kinds of QuEChERS purification columns

1.2.2 溶液配制 混合標準溶液：取14種農藥標準品溶液（100 mg/L）各100 μL于10 mL容量瓶，加入乙腈定容，得到濃度為1 mg/L的混合標準溶液，于-20 ℃冰箱保存。

空白基質溶液：稱取1 g（精確至0.001 g）空白綠茶/紅茶樣品，按照1.2.1節進行提取和凈化，得到相應的空白綠茶/紅茶基質溶液，將該溶液置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

基質混合標準溶液1：用空白基質溶液將混合標準溶液稀釋得到0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 μg/L等系列質量濃度的基質混合標準工作溶液，用于確定方法檢出限和定量限。

基質混合標準溶液2：用空白基質溶液將混合標準溶液逐級稀釋得到質量濃度為1、5、10、20、50、100 μg/L的系列基質混合標準工作溶液，用于做標準工作曲線，即基質匹配校準曲線。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：SHIMAZU Shim-pack Velox Biphenyl C18色譜柱（3 mm×50 mm，2.7 μm）。分別考察乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇（含2 mmol/L甲酸銨）、0.1%甲酸水溶液-甲醇（含5 mmol/L甲酸銨）四種流動相對14種農藥檢測結果的影響。流動相洗脫程序：0～0.01 min，5% B；0.01～1.0 min，5%～40% B；1.0～3.0 min，40%～85% B；3.0～4.5 min，85%～95% B；4.5～8.0 min，95% B；8.01～10 min，95%～5% B。進樣體積設置為5 μL；流速設置為0.3 mL/min；色譜柱柱溫35 ℃。

1.2.4 質譜條件 離子源：ESI離子源；將14種農藥混合標準溶液通過針泵進樣方式進行質譜方法調諧，在ESI+和ESI-模式下進行掃描，優化各化合物的質譜條件；檢測方式：多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源電壓：5500 V；離子源溫度：500 °C；氣簾氣：35 psi；霧化氣：65 psi；輔助加熱氣：55 psi。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 基質效應 茶葉的基質較復雜，可能存在基質抑制或基質增強效應。分別用廠家1復雜基質凈化柱處理所得的空白綠茶基質和1%乙酸-乙腈提取溶劑配制濃度為50 μg/L的14種混合農藥標準溶液，重復測定3次，考察14種農藥在綠茶中的基質效應。

基質效應（Matrix effect，ME）按下式計算：

式中：ME表示基質效應，%；Amatrix表示基質混合標準溶液中目標分析物的峰面積（A，peak area）；Aextraction表示提取溶劑混合標準溶液中目標分析物的峰面積。

1.2.5.2 方法的線性范圍、檢出限、定量限 采用基質匹配標準溶液建立標準曲線。按照1.2節描述配制質量濃度為1、5、10、20、50、100 μg/L的系列基質混合標準工作液，以各個農藥的峰面積為縱坐標，相應的濃度為橫坐標，獲得目標物農藥的線性回歸方程，分別以信噪比（S/N）為3和10時對應的空白樣品添加濃度為檢出限（Limit of detection, LOD）和定量限（Limit of quantification, LOQ）。

1.2.5.3 回收率和精密度 分別在空白綠茶和紅茶樣品中添加低、中、高濃度（100、500、800 μg/kg）農藥進行加標回收率試驗，各濃度平行試驗6次，計算平均回收率及測定結果的相對標準偏差（RSD）。

1.2.5.4 實際茶樣品檢測 利用本文方法對市售的30種茶葉進行檢測，分析其中14種目標農藥的殘留濃度。

1.3 數據處理

分別利用Analyst 1.7和Sciex OS 1.7.0軟件進行數據采集及處理，Origin 9.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 色譜、質譜條件優化

使用SHIMAZU Shim-pack Velox Biphenyl C18色譜柱（3 mm×50 mm，2.7 μm），設定流速為0.3 mL/min，分別考察了以乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇（含2 mmol/L甲酸銨）、0.1%甲酸水溶液-甲醇（含5 mmol/L甲酸銨）為流動相對14種農藥檢測結果的影響，梯度洗脫程序見1.2.3。結果表明，選用0.1%甲酸水溶液-甲醇（2 mmol/L甲酸銨）為流動相時，14種農藥的響應值和峰形最好。14種農藥的總離子流圖見圖1。

將14種農藥的0.1 mg/L混合標準溶液通過針泵進樣方式進行質譜方法調諧，在ESI+和ESI-模式下進行掃描。結果顯示，14種農藥的母離子均為[M+H]+模式。手動調諧優化14種農藥母離子和子離子，選取兩組靈敏度最佳的離子對作為定量離子對和定性離子對，獲得最佳的碰撞電壓和碰撞能量，最終得到MRM模式下14種農藥優化的質譜采集參數如表2所示。

表2 14種農藥的質譜參數Table 2 MS parameters of the 14 pesticides

2.2 提取方法選擇

QuEChERS樣品前處理主要由提取和凈化兩部分組成。在提取階段，常用的提取溶劑有乙腈、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、正己烷等。乙腈因最適宜于提取各種極性的農藥殘留，同時不會萃取出很多油性物質（如蠟、油性色素、脂肪等），且僅需加入鹽便可實現與水相的分離，是目前使用最廣泛的提取溶劑。研究表明，在乙腈中加入1%乙酸，并在鹽析過程中加入MgSO4和緩沖鹽CH3COONa可對絕大多數農藥殘留得到較高的回收率[23]。另外，對于含水量低的樣品，通過先向樣品中添加一定量的水，可弱化待分析物與樣品基質之間的相互作用，使待分析物更易在萃取/分配過程中被充分提取[24]。

本研究首先向茶葉樣品中加入適量水充分浸潤，再分別使用乙腈及含1%乙酸的乙腈作為提取溶劑，震蕩均勻后加入含6 g MgSO4和1.5 g CH3COONa的鹽包，進行提取效果的比較，結果表明（圖2），采用1%乙酸-乙腈作為提取溶劑時，其農藥回收率高于乙腈作為提取溶劑，因此，本文選擇1%乙酸-乙腈作為提取溶劑。

圖 2 不同提取液對目標化合物回收率的影響Fig.2 Effect of different extracts on target compound recovery

2.3 凈化方式優化

茶葉樣品基質復雜，其中的茶多酚、咖啡因、色素、有機酸等物質易和待測目標物共提取，干擾檢測的準確性和靈敏度[6]。常見的凈化劑有無水MgSO4、PSA、GCB和C18等。無水MgSO4能除去提取液的少量水分，PSA可有效去除脂肪酸、有機酸、一些極性色素和糖類，GCB能有效去除具有平面結構的甾醇和色素類雜質，C18吸附劑對油脂的去除效果十分明顯[25]。另外，一些新型凈化材料如多壁碳納米管（MWCNTs）和石墨烯等因被證實能有效去除基質中色素類、糖類、氨基酸等干擾物，并在一定程度上改善GCB對部分平面結構化合物的吸附問題，也逐漸得到應用[26-27]。傳統的凈化方法是向提取液中加入一定量吸附劑，充分震蕩使吸附劑與樣品充分反應，最后離心去除吸附劑。為了使操作更加快速高效，本文使用將凈化劑固相化的QuEChERS凈化柱對提取液進行凈化，省去震蕩、渦旋和離心等步驟從而縮短了樣品前處理時間。

本文考察了在空白綠茶和紅茶樣品中添加800 μg/kg目標化合物，采用兩個廠家四種商品化QuEChERS凈化柱（成分及含量見表1）對茶葉提取液凈化效果和農藥回收率的影響。如圖3所示，由茶葉提取液經不同凈化柱凈化后的顏色深淺可初步判斷，復雜基質凈化柱對于色素雜質的凈化效果好于簡單基質凈化柱，這是因為復雜基質凈化柱中的GCB或MWCNTs對色素有很好的吸附作用。根據圖4可知，對于綠茶樣品，廠家1簡單基質凈化柱對14種農藥的回收率（56.3%～91.1%）整體低于廠家1復雜基質凈化柱（73.4%～112.4%），且色譜圖中雜峰較明顯（見圖5），可見含有GCB（5 mg）的復雜基質凈化柱能有效吸附色素等雜質，降低提取液中高濃度雜質對目標分析物檢測的影響；綠茶樣品經廠家2簡單基質凈化柱處理后對14種農藥回收率（42.7%～79.3%）和經廠家2茶葉專用柱凈化后對14種農藥回收率（52.7%～71.2%）整體低于廠家1凈化柱，說明廠家2兩種凈化柱中較高含量的MWCNTs（分別為15和45 mg）對目標化合物產生了一定吸附從而導致回收率降低。對于紅茶樣品，采用四種凈化柱處理后14種農藥回收率整體高于綠茶樣品，且凈化后樣品顏色比綠茶淺，說明綠茶和紅茶在茶多酚、生物堿、色素等成分上的差異會影響凈化效果和檢測結果，在實際檢測中應根據樣品具體情況進行優化。

圖 3 綠茶和紅茶經不同凈化柱處理后茶葉提取液的顏色對比Fig.3 Comparison of green tea and black tea extracts using different purification columns

圖 4 不同凈化柱對目標化合物回收率的影響Fig.4 Effect of different purification columns on the target compound recovery

圖 5 總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatograms （TIC）

綜合考慮，本文使用凈化效果和回收率都較好的廠家1復雜基質凈化柱，進一步考察方法的基質效應、線性關系、回收率等，并對實際樣品進行檢測。

2.4 基質效應

茶葉中的茶多酚、生物堿、色素等易和目標物分析物共提取，難以通過凈化全部去除，從而對目標分析物的離子化效率產生影響，即產生基質效應（Matrix effect，簡稱ME）[28-29]。我們分別用廠家1復雜基質凈化柱處理所得的空白綠茶基質和1%乙酸-乙腈提取溶劑配制濃度為50 μg/L的14種混合農藥標準溶液，重復測定3次，考察14種農藥在綠茶中的基質效應。由表3可以看出，綠茶基質對14種農藥的基質效應不同，10種農藥ME＞105%，為基質增強；2種農藥ME＜85%，為基質抑制；2種農藥ME在85%～105%之間，表示無基質效應。因此，對茶葉農殘檢測，采用空白基質配制標準曲線進行定量分析以減弱基質效應的影響，提高定量結果的準確性。

表3 14種農藥的線性方程、決定系數、檢出限、定量限、基質效應和最大殘留限量Table 3 Linear equations, coefficient of determination (R2), LODs, LOQs, matrix effects and the maximum residue limits of 14 pesticides

2.5 線性關系、檢出限、定量限

由表3可知，14種農藥在相應的線性范圍內線性關系良好，R2＞0.99。以信噪比（S/N）為3和10時對應的空白樣品添加濃度為檢出限（Limit of detection,LOD）和定量限（Limit of quantification, LOQ），14種農藥LOD在0.001～2.000 μg/L之間，LOQ為0.003～5.000 μg/L。根據GB 2763-2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》，除涕滅威在茶葉中的最大殘留量未做規定，其余13種農藥的檢出限和定量限均遠低于規定的最大殘留量，說明本文方法滿足實際檢測需求。

2.6 回收率和精密度

如表4所示，在向空白綠茶和紅茶樣品中添加低、中、高濃度（100、500、800 μg/kg）三個濃度水平下，方法的平均回收率為71.2%～117.4%，RSD為1.1%～14.2%，說明該方法對綠茶和紅茶中14種農藥殘留檢測的準確度和精密度良好，能夠滿足茶葉樣品多農藥殘留分析的要求。

表4 14種農藥在綠茶和紅茶中的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of the 14 pesticides spiked in green tea and black tea (n=6)

2.7 實際樣品檢測

利用本文方法對市售的30種茶葉進行檢測，如表5所示，有6種茶葉檢出目標農藥，其中5種茶葉檢出啶蟲脒，殘留量為2.4～14.1 μg/kg；2種茶葉檢出克百威，殘留量分別為1.9、23.0 μg/kg；2種茶葉檢出吡蟲啉，殘留量分別為1.9、33.7 μg/kg；1種茶葉檢出茚蟲威，殘留量為3.0 μg/kg；1種茶葉檢出噻蟲嗪，殘留量為2.4 μg/kg。上述茶葉中農藥殘留均未超過國家標準GB 2763-2021規定的最大殘留限量值。

表5 6種檢出目標農藥的茶葉中農藥殘留濃度（μg/kg）Table 5 Concentration of targeted pesticides detected in six tea samples

3 結論

本文采用QuEChERS前處理方法結合UPLCMS/MS技術，建立了茶葉中啶蟲脒、涕滅威、克百威、內吸磷、滅線磷、吡蟲啉、茚蟲威、甲胺磷、滅多威、氧化樂果、甲基對硫磷、硫環磷、丙溴磷、噻蟲嗪等14種農藥殘留的快速檢測方法。通過優化提取液組分、QuEChERS凈化柱種類等，14種農藥的LOQ可達到0.003～5.000 μg/L，在3個添加水平下的回收率為71.2%～117.4%，能夠滿足茶葉農藥殘留限量指標的快速檢測要求。對30種市售茶葉樣品進行檢測，其中6種茶葉檢出目標農藥，測得農藥殘留濃度均未超過國家限量標準。本文方法具有操作簡便快捷、凈化效果好、靈敏度和準確率高等優點，為高效和準確地評價茶葉的質量安全提供了新的參考。