室內袋式和管道式光生物反應器對湛江等鞭金藻生長及生化組分的比較分析

呂布 陳煜 李曦 李嬌妮 臧戰 石耀華 VASQUEZ Hebert Ely,2 鄭興,2 顧志峰,2

(1 海南大學海洋學院，海南海口 570228；2 海南大學南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南海口 570228)

海洋微藻營養組成豐富，可以有效地將無機營養物質、水、二氧化碳和其他物質轉化為有機化合物，如碳水化合物、蛋白質和脂質[1-2]。湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)是一種海洋金黃色鞭毛微藻[3]，是分布于我國南方湛江灣地區的海洋浮游單細胞藻類，具有生長快速、營養豐富、不含纖維素細胞壁、富含多不飽和脂肪酸等特點。該藻可應用于不同的飼料工業和海水養殖系統，如在對蝦和雙殼類幼體養殖中作為優質餌料等。該藻可在室內和室外廣泛養殖并大量生產，具有大規模培養的潛力。目前有關湛江等鞭金藻的研究在多不飽和脂肪酸和多糖方面較多，對其蛋白質方面的研究較少[4-5]。該藻的最適生長溫度為25 ℃[6]，然而我國南方地區夏季藻類培養池的水溫經常高達35 ℃以上[7]，嚴重阻礙了其生長和繁殖，從而提高了生產成本和養殖風險[8]。

微藻的高密度培養主要分為管道式、平板式、柱式和浮式薄膜袋式等[9-11]。近年來我國微藻產業發展迅速，養殖基地遍布全國，但養殖基地大多采用玻璃鋼桶、跑道式水泥池等設施養殖微藻，這些設施構造簡單、成本低廉、操作方便，但占地面積大，易發生污染問題[12]。有學者利用聚乙烯薄膜袋培養微藻，顯著降低了生產成本。聚乙烯薄膜袋具有采光面積較大、保溫性能穩定、不易被污染、操作方便等優點，但薄膜袋易破損漏水，難以實現規模化培養[13-14]。管道式光生物反應器是近年來微藻戶外培養時常用的一種培養裝置，具有光照表面積大、結構可調節性強等特點，被廣泛應用于微藻生產，可提高微藻生產率和光合效率[11,15-16]，其可靠性、有效性和低成本等優點日益引起人們的重視，具有較好的應用前景。

本研究通過比較在管道式光生物反應器與傳統聚乙烯袋式培養環境中湛江等鞭金藻的生長、葉綠素含量和有機物含量變化等情況，從藻密度、色素含量和有機物含量的角度綜合評價這2種模式的培養效果，以期為采用管道式光生物反應器開展室內微藻培養提供科學依據，并探索湛江等鞭金藻細胞室內大規模培養的可行性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用湛江等鞭金藻來自海南大學海洋學院微藻保種室。試驗前將藻種進行純化擴培，取快速生長期的藻液開展室內培養試驗。

試驗用培養液為課題組基于“寧波3#”微藻培養液優化所得。具體配方為：化肥尿素50 mg、NaH2PO410 mg、FeSO42.5 mg、MnSO40.25 mg、EDTA-2Na 10 mg、VB16×10-3mg、VB120.5×10-6mg、過濾海水1 L。

試驗用水為經過沙井過濾、沉淀、漂白水消毒后的自然海水。

室內培養過程中的溫度、光照強度、光周期等理化條件為人工控制條件。

1.2 試驗設計

試驗于2020年12月—2021年1月在海南省文昌市進行。根據培養模式分為2個試驗組，即管道式光生物反應器組和聚乙烯袋組，每組設3個平行。管道式光生物反應器的供氣系統由泵、輸氣管、調節閥組成，工作體積約為1 000 L；聚乙烯袋的工作體積約40 L(見圖1)。試驗充氣量在單位體積內統一控制在20 L/min，接種細胞密度約為10.0×104cells/mL。試驗水溫維持在(25±1) ℃，光照強度控制在5 500 lx，光暗周期比為12 h∶12 h(光照∶黑暗)，試驗持續16 d。

將處于指數生長期的湛江等鞭金藻用培養基調整到相同數量級(104cells/mL)，經離心(3 500 r/min，10 min)后分別接種至1 000 L的管道式光生物反應器和40 L的聚乙烯袋中。

各試驗組接入藻種并混勻后，每隔24 h進行取樣。將樣品依次通過Whatman GF/C過濾膜進行抽濾，獲得藻細胞。將收集好的濾膜分別放入離心管中冷凍保存，將藻液留在取樣瓶中，于4 ℃條件下保存。

(a)管道式光生物反應器；(b)聚乙烯袋

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 藻細胞數目測定

采用血球計數板法進行測定。

1.3.2 藻細胞干質量測定

預先稱量烘干Whatman GF/C過濾膜，將一定體積的藻液在該膜上過濾，經過沖洗去除營養鹽，放到105 ℃烘箱中烘干72 h以上后稱量，直至前后兩次質量差不超過2 mg，然后計算烘干后微藻+濾膜與濾膜兩者質量的差值，即為藻細胞的干質量[17]。

1.3.3 胞內生物質測定

葉綠素含量：利用丙酮萃取法提取微藻體內的葉綠素。取待測藻液樣品20 mL，抽濾至Whatman GF/C膜上，隨后用鑷子將膜取下，置于50 mL離心管底部，加入10 mL的90 %丙酮溶液，立即放入4 ℃冰箱中避光保存1～3 d，在黑暗、低溫條件下進行萃取。萃取后，在4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min。將離心后的提取液上清液小心注入1 cm比色皿中。以90%丙酮溶液作參比，用分光光度計(島津UV-1700)分別測定在波長630、647、664 nm處溶液的吸光度值。計算減去波長750 nm下測得的吸光度值，得到校正后的E664、E647、E630值。按照以下 方程式計算葉綠素a(Cchla，mg/L)、葉綠素b(Cchlb，mg/L)和總葉綠素(Ctchl，mg/L)的質量濃度[18]。

Cchla=(11.85E664-1.54E647-0.08E630)×10/V

(1)

Cchlb=(21.03E647-5.43E664-2.66E630)×10/V

(2)

Ctchl=(20.21E647+8.02E664)×10/V

(3)

式(1)～(3)中，Cchla、Cchlb、Ctchl分別為葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素的質量濃度(mg/L)，E630、E647、E664分別為在波長630、647、664 nm處溶液的吸光度值，V為試驗用藻液體積(mL)。

總蛋白質含量：稱取0.1～0.3 g被測樣品，包于特制錫箔中，并置于自動落樣器上。樣品在燃燒反應爐(960 ℃)、通氧量170 mL/min條件下充分燃燒300 s，直至氧剩余量為12%時停止燃燒。燃燒反應爐中的試劑依次為280 g氧化銅(CuO)、13 g銀(Ag)絲、15 g鉑(Pb)。燃燒爐中的產物放入TC檢測器(Rapid N Ⅲ，Elementar公司)檢測[19]。

可溶性糖含量：稱取0.1 g被測樣品，按照待測樣本質量(g)∶蒸餾水(mL)=1∶10的比例加入蒸餾水，沸水浴加熱60 min。之后取出離心管，再加30 mg活性炭，混勻，放置30 min，過濾，加3 mL無水乙醇，再用蒸餾水定容至15 mL。取1 mL提取液于刻度離心管內，加5 mL蒽酮試劑，擰上蓋子，沸水浴10 min后，將離心管冰水浴或用自來水沖洗冷卻至室溫停止反應。停止反應后20 min，用紫外分光光度計測得630 nm處的吸光度值，另外用標準葡萄糖溶液以相同的反應條件和檢測方法做標準曲線。比對標準曲線，計算樣品的可溶性糖含量[20]。

1.4 數據處理與統計

生產力Px[g/(L·d)]和比生長速率μ(d-1)通過下述公式計算[21]。

Px=(Cm-Ci)/tc

(4)

μ=(lnCm-lnCi)/tc

(5)

式(4)～(5)中，Ci為初始生物量質量濃度(g/L)，Cm為最大生物量質量濃度(g/L)，tc為與最大生物量濃度有關的培養時間(d)。

試驗數據以“平均值±標準差”的方式表示。采用EXCEL 2016和DPS 14.5軟件進行數據處理和統計分析。采用單因素方差分析法進行差異性顯著分析，設P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 兩種養殖模式下湛江等鞭金藻生產力和比生長速率的差異

由表1可見，管道式光生物反應器養殖模式下湛江等鞭金藻的生產力和比生長速率顯著優于聚乙烯袋培養模式(P<0.05)。

表1 兩種養殖模式下湛江等鞭金藻生產力和比生長速率的差異

2.2 兩種養殖模式下湛江等鞭金藻生長密度的差異

在兩種養殖模式下，湛江等鞭金藻的生長整體均呈先緩慢增長后快速增長，隨后呈穩定狀態，最后開始降低的趨勢，但管道式光生物反應器模式的變化趨勢更加明顯(見圖2)。

在管道式光生物反應器模式下，湛江等鞭金藻從第4天開始進入快速生長期，其細胞密度為(0.72±0.09)×106cells/mL，并在第7天細胞密度達到峰值，為(1.97±0.14)×106cells/mL，之后開始進入平穩期。在聚乙烯袋模式下，湛江等鞭金藻生長趨勢相對平緩，于第9天達到峰值，其細胞密度為(0.99 ± 0.02)×106cells/mL，顯著低于管道式光生物反應器模式下的峰值(P<0.05)。

注：不同大寫字母代表相同養殖模式下不同養殖時長之間存在顯著性差異，不同小寫字母代表相同養殖時長不同養殖模式之間存在顯著性差異(P<0.05)，下同。

2.3 兩種養殖模式下湛江等鞭金藻葉綠素a、b和總葉綠素含量的差異

兩種養殖模式下，湛江等鞭金藻葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素質量濃度整體都呈先緩慢增長后快速增長，隨后呈穩定態勢，最后開始降低的趨勢，且管道式光生物反應器模式下的變化趨勢更明顯(見圖3～5)。

圖3 兩種養殖模式下湛江等鞭金藻葉綠素a的差異

圖4 兩種養殖模式下湛江等鞭金藻葉綠素b的差異

圖5 兩種養殖模式下湛江等鞭金藻總葉綠素的差異

管道式光生物反應器模式下，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素質量濃度在第4天開始進入快速增長期，并在第7天達到峰值(分別為0.46、0.44、0.92 mg/L)后進入平穩期。聚乙烯袋模式下，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的增長趨勢相對平緩，三者質量濃度的峰值顯著低于管道式光生物反應器模式下的(P<0.05)。聚乙烯袋組在養殖第9天，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的質量濃度分別達到峰值0.26、0.26、0.52 mg/L。

2.4 兩種養殖模式下湛江等鞭金藻有機物含量對比

在管道式光生物反應器培養模式下，湛江等鞭金藻有機物的質量濃度比在聚乙烯袋培養模式下的要高，且二者間有機物含量存在顯著性差異(P<0.05)(見表2)。管道式光生物反應器模式下，湛江等鞭金藻有機物的最大生物量(干質量)、最高總蛋白質質量濃度和最大可溶性糖質量濃度分別達(0.160 1±0.004 0)g/L、(107.267 7±9.632 8)mg/L、(9.587 8±0.868 1)mg/L，均顯著高于聚乙烯袋模式(P<0.05)。湛江等鞭金藻單細胞胞內有機物的含量兩種模式之間沒有顯著性差異(P>0.05)(見表3)。

表2 兩種培養模式下湛江等鞭金藻有機物含量比較

表3 兩種培養模式下湛江等鞭金藻單細胞胞內有機物含量比較

3 討論

3.1 兩種養殖模式下湛江等鞭金藻的生長及差異

微藻的大規模培養已成為微藻產業化中公認的難點和熱點。光生物反應器作為生產高附加值微藻產品的技術平臺，其中的管道式光生物反應器由于發展快、應用廣泛而極具代表性。但在反應器的設計方面，各種微藻的最佳培養條件和最低成本消耗仍需不斷地進行探索。藻種、外界環境和培養方式等是微藻培養過程中常見的影響因素[22]。其中光照是光生物反應器最主要的影響因子，影響微藻生長的主要因素還有溫度、pH等[23]。劉青等[24]使用錐形瓶在光照培養箱中培養湛江等鞭金藻，試驗設置了5個光照強度梯度，發現該藻生長的最適光照強度為5 000 lx，在此光照條件下，其生長速率最大可達0.188個/d，葉綠素質量濃度最高為282.64 μg/L。本試驗接種的是同一藻種，采用LED燈作為光源，光照強度為5 500 lx，在室內溫度為(25±1)℃的條件下，在管道式光生物反應器中培養，湛江等鞭金藻最大藻密度、比生長率和葉綠素質量濃度分別為1.97×106cells/mL、0.396 7/d和0.92 mg/L，明顯優于聚乙烯袋式培養模式和劉青等[24]的試驗結果。這可能是由于管道式光生物反應器管徑較小，玻璃材質的管壁透光性好，光照均一性好，顯著提高了光照效率[25]，從而促進了微藻的快速生長，提高了培養密度，縮短了培養周期。

3.2 兩種養殖模式下湛江等鞭金藻葉綠素及有機物含量的差異

不同培養模式會影響藻細胞的葉綠素含量。在管道式光生物反應器模式和聚乙烯袋模式下，分別在7 d和9 d內，湛江等鞭金藻的葉綠素含量均隨著藻細胞生長而增加，并在第7天和第9天分別達到最高值(0.92、0.52 mg/L)。單位水體葉綠素含量的變化反映了藻類密度或生物量的變化。當藻類生長速率較高時，生物量一般也較高，二者的變化趨勢相近[24]。本試驗的結果也表明，在相同的光照強度和周期下，湛江等鞭金藻的葉綠素含量與其比生長速率成正比，比生長速率越快，葉綠素含量越高。

本研究發現，在試驗周期內，管道式光生物反應器、聚乙烯袋中湛江等鞭金藻有機物的質量濃度并不一致。在管道式光生物反應器模式下，湛江等鞭金藻生物量(干質量)和可溶性糖含量顯著高于聚乙烯袋養殖模式。在管道式光生物反應器模式下，湛江等鞭金藻的總蛋白質含量顯著高于聚乙烯袋模式，主要原因是聚乙烯袋模式培養的藻生物量過低，導致最后蛋白質產量也較低。與董學衛等[26]使用平板式半連續培養的湛江等鞭金藻相比，本試驗管道式光生物反應器模式下湛江等鞭金藻的蛋白質含量較高，而可溶性糖含量要低于前者試驗多糖的含量。本試驗結果表明，養殖模式對湛江等鞭金藻生物量、蛋白質和可溶性糖含量的影響程度不同。其中，管道式光生物反應器對湛江等鞭金藻生長的促進作用最為顯著。隨著科學技術的發展和生產的實際需求，更好的管道式光生物反應器模式將會被開發并應用于微藻規模化培養，微藻養殖有望成為水產養殖業新的經濟致富點。

4 結論

管道式光生物反應器可以提高光照效率，有利于湛江等鞭金藻的生長，縮短其培養時間，并且適用于微藻的高密度培養。同時，管道式光生物反應器可以解決湛江等鞭金藻生產周期長及產量不足的問題，為其進一步的規模化應用奠定了基礎。