高效液相色譜法測定天然本草類牙膏中黃芩苷含量

陳杰鋒 高 艷

(無限極(中國)有限公司，廣東廣州510000)

引言

中草藥牙膏是我國口腔清潔護理用品行業的特色，開發中草藥牙膏是促進中醫藥傳承創新發展的具體體現之一。中藥黃芩為草本植物黃芩根的提取物，在中藥學中，被認為味苦、性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，在口腔護理用品的應用歷史由來已久。現代藥理研究表明中藥黃芩提取物的主要成分為黃酮類分子，其中較高的是黃芩素和黃芩甙[1]。黃芩苷具有降壓、鎮靜、保肝、抗菌、消炎等多種藥理作用[2]。《中國藥典》記載黃芩苷是黃芩藥材的活性成分之一，且對藥材中黃芩苷的含量有要求。研究了牙膏中黃芩苷含量的測定方法，用于去判斷牙膏中加了黃芩提取物以及其在牙膏產品中穩定性。

1 實驗和方法

1.1 儀器與材料

①Agilent 1200Series高效液相色譜儀系統(G1329A ALS，G1311A Quat Pump，G1322A Degasser，G1316A TCC，G1315D DAD)；

②梅特勒-托利多XSE205型電子天平(感量0.01mg)；

③梅特勒-托利多ML204T型電子天平(感量0.1mg)；

④昆山市超聲儀器有限公司KQ-400DE型數控超聲波清洗器；

⑤Thermo Fisher Sorvall ST 16R離心機；

⑥IKA MS3渦旋振蕩器；

⑦黃芩苷標準品(中國食品藥品檢定研究所，含量以95.4%計)；

⑧植雅牙膏(規格：140克/支，無限極(中國)有限公司生產)；

⑨乙腈(色譜純，默克股份兩合公司)；

⑩無水乙醇(色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；

1.2 色譜條件

①色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm)；

②流動相：A相(乙腈)，B相(0.1%磷酸溶液)，梯度洗脫，見表1；

表1 流動相梯度洗脫表

③流量：1.0mL/min；

④柱溫：30℃；

⑤進樣量：10μL；

⑥檢測波長：277nm。

1.3 標準品溶液的制備

黃芩苷標準儲備溶液：精密稱取黃芩苷標準品50mg(精確至0.01mg)至250mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成200μg/mL標準儲備溶液。

1.4 供試品溶液的制備

稱取試樣1g(精確至0.1mg)于50ml具塞刻度離心管中，加入約1g石英砂，再準確加入乙醇-磷酸混合溶液(無水乙醇+磷酸+水=50+6+44，體積比)20mL，稱定質量，渦旋振蕩2min，25℃水浴中超聲提取40min，冷卻至室溫后用乙醇-磷酸混合溶液補足損失質量，5000r/min離心分離10min，取上清液經0.22μm微孔濾膜過濾，濾液作為試樣溶液上機待測。

1.5 測定和計算

按上述條件測定標準工作溶液和待測溶液，根據色譜峰的保留時間和紫外光譜圖定性，根據標準工作溶液濃度和色譜峰面積回歸直線方程定量，按公式(1)計算樣品中黃芩苷的含量。

(1)

式中：X——試樣中黃芩苷的含量，mg/kg；

C——從標準曲線中得出的黃芩苷濃度，μg/mL；

V——試樣溶液的體積，mL；

m——試樣質量，g。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的確定

2.1.1 根據黃芩苷的結構以及理化性質，對提取溶劑和提取方法進行考察，篩選合理的提取方法。考慮到牙膏試樣在水中分散效果較好，本次實驗采用有機溶劑-水體系作為提取溶劑。考察了不同比例的甲醇水溶液和乙醇水溶液(30%，50%，70%，90%，100%)對含有黃芩苷的牙膏試樣的提取效果，結果見圖1。當有機溶劑比例從30%增大到50%時，甲醇-水和乙醇-水作為提取溶劑，均測得試樣中黃芩苷的含量逐漸增多，在比例在50%時，測得含量最大值。有機溶劑比例超過50%后，繼續增大其比例，黃芩苷的含量逐漸減少。綜合兩個溶劑體系對黃芩苷的提取情況，使用50%乙醇水溶液測得的黃芩苷含量最高。同時，考慮到牙膏一般具有較好的水分散性，提取溶劑中有機溶劑的比例越高，牙膏在提取溶劑中的分散效果越差。因此選擇50%乙醇水作為黃芩苷的提取溶劑。另外，為了提高牙膏在提取溶劑中的分散效果，本次實驗選擇加入適量石英砂對牙膏試樣進行輔助分散。

圖1 不同比例有機溶劑水溶液的提取效果對比

2.1.2 提取溶劑中磷酸濃度的選擇

黃芩苷在酸性條件下的化學性質更穩定[3]，在提取溶劑中添加一定濃度的磷酸可使碳酸鈣基質牙膏溶解更充分，提高黃芩苷的提取效率。本次實驗考察了在溶劑中添加不同濃度的磷酸(0%，0.5%，1%，2%，4%，6%，8%，10%)(體積分數)對含有黃芩苷的牙膏試樣的提取效果影響，結果見圖2。隨提取溶劑中磷酸濃度逐漸增大，測得試樣中黃芩苷含量逐漸增多，其中提取溶劑中添加磷酸濃度為6%、8%、10%時，黃芩苷提取的效果明顯優于其他濃度。同時測得提取溶劑中磷酸濃度為6%、8%、10%時，其pH值分別為1.41、1.24、1.11。綜合考慮到提取溶劑酸性過大可能會對色譜柱的性能及使用壽命造成一定影響，且提取溶劑中磷酸濃度為6%、8%、10%時，提取效果差異較小，因此選擇在提取溶劑添加磷酸的濃度為6%，即乙醇-磷酸-水溶液(50+6+44)(體積比)作為本方法的提取溶劑。

圖2 提取溶劑中不同磷酸濃度的提取效果對比

2.2 儀器色譜條件的確定

2.2.1 檢測波長的選擇

通過使用二極管陣列檢測器(DAD)對黃芩苷標準品溶液在190-400nm波長范圍內進行掃描，結果顯示(見圖3)，黃芩苷在紫外光214nm，277nm，316nm波長處均有特征收。由于214nm波長處容易受到流動相的影響，316nm波長處吸光度值較小，皆不適合作為檢測波長，綜合考慮，本方法選擇277nm作為檢測波長。

圖3 黃芩苷標準溶液的紫外吸收光譜圖

2.2.2 色譜柱的選擇

本次實驗考察了Agilent Eclipse Plus C18、Agilent ZORBAX SB-Aq、Waters Xbridge C18和Agilent TC-C18(2)等不同型號相同規格(250mm×4.6mm，5μm)的C18色譜柱對黃芩苷和試樣基質的分離效果。結果顯示，在優化的流動相條件下各種C18色譜柱能實現黃芩苷和試樣基質的有效分離，尤其使用Agilent Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱時，峰形尖銳對稱。綜合考慮，最終選擇使用C18色譜柱作為分離色譜柱。

2.2.3 流動相的選擇

本次實驗比較了甲醇-水溶液及乙腈-水溶液兩種流動相體系對黃芩苷和試樣基質的分離效果。結果顯示，在乙腈-水溶液流動相體系下采用梯度洗脫能夠實現黃芩苷和試樣基質的良好分離，尤其當水相中加入0.1%濃度的磷酸時，色譜峰峰形對稱、響應值較高。因此，本方法采用乙腈-0.1%磷酸作為流動相。

2.3 線性范圍與檢出限

分別精密量取1.3步驟中黃芩苷標準儲備溶液0.25mL、2.5mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、25.0mL置于50mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別配制成濃度為1.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、60.0μg/mL、100.0μg/mL的標準溶液系列，依前述色譜條件進行測定。記錄色譜峰峰面積，以標準工作溶液濃度(μg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得出黃芩苷的回歸方程為：

y=27.6365x-2.3628

R2=0.9999

由以上回歸方程可知黃芩苷在1.0μg/mL～100.0μg/mL之間呈良好線性關系。

取牙膏試樣按1.4步驟制備待測溶液，通過將該測試溶液逐級稀釋并上機測試，測定目標物的信噪比(S/N)，將所得信噪比大于3時對應的稀釋后濃度作為方法的檢出濃度，結果顯示，本方法的檢出濃度為0.05μg/mL。當試樣稱樣量為1g，溶液定容體積為20mL時，方法檢出限為1mg/kg。

2.4 方法特異性

本次實驗分別考察了3種基質牙膏(二氧化硅基質、碳酸鈣基質和磷酸氫鈣基質)陰性樣品和添加黃芩苷標準品后的色譜圖。結果如圖4～9所示，表明三種基質中存在的物質對本方法目標檢測物質沒有干擾。

圖4 二氧化硅基質(陰性樣品)牙膏溶液譜圖

圖5 二氧化硅基質(陰性樣品)牙膏加標溶液譜圖(1：黃芩苷)

圖6 碳酸鈣基質(陰性樣品)牙膏溶液譜圖

圖7 碳酸鈣基質(陰性樣品)牙膏加標溶液譜圖(1：黃芩苷)

圖8 磷酸氫鈣基質(陰性樣品)牙膏溶液譜圖

圖9 磷酸氫鈣基質(陰性樣品)牙膏加標溶液譜圖(1：黃芩苷)

2.5 重復性試驗

分別平行稱取三種不同基質牙膏試樣6份，依照1.4步驟制備的供試品溶液，依前述色譜條件進樣測定黃芩苷含量，結果見表2。6次進樣測得三種不同基質牙膏中黃芩苷含量平均值分別為799mg/kg、749mg/kg、780mg/kg，RSD分別為0.6%、2.2%、2.9%。結果表明，該方法重復性良好。

表2 三種基質試樣重復性測定結果

2.6 中間精密度試驗

由不同操作人員A、B，分別對同一批次牙膏試樣平行稱取樣品6份，依照1.4步驟制備供試品溶液，依前述色譜條件進樣測定黃芩苷含量，結果見表3。測得牙膏試樣中黃芩苷含量平均值分別為749mg/kg和748mg/kg，RSD為1.9%。結果表明，該方法中間精密度良好。

表3 黃芩苷含量測定的中間精密度實驗數據

2.7 準確度(回收率)試驗

分別平行稱取三種基質(二氧化硅、碳酸鈣、磷酸氫鈣)牙膏試樣(陽性樣品)各9份，每份約0.5g(稱樣量減半)，共三組，分別定量加入黃芩苷標準溶液，添加濃度水平為試樣本底含量的50%、100%、150%，按1.4步驟處理后進行上機測定，結果見表4～6。從表中可看出，三種基質牙膏試樣在不同加標濃度下的平均加標回收率為94.0%～97.9%，RSD為0.4%～2.4%。結果表明，本方法準確可靠，精密度高。

表4 二氧化硅基質牙膏試樣加標回收率測定結果

表5 碳酸鈣基質牙膏試樣加標回收率測定結果

表6 磷酸氫鈣基質牙膏試樣加標回收率測定結果

2.8 穩定性試驗

取牙膏試樣按1.4步驟制備供試品溶液，依前述的色譜條件在0h、6h、12h、18h、24h分別進樣，測定黃芩苷含量，結果見表7。牙膏試樣中黃芩苷含量平均值為727mg/kg，RSD為0.9%，結果表明，在24小時內供試品溶液穩定性良好。

表7 放置時間對黃芩苷測試結果的影響

2.9 樣品測試

分別取5個不同批次天然本草類牙膏試樣，每批次平行取樣2份，依照1.4步驟制備供試品溶液，上機進樣測定黃芩苷含量，結果分別見表8。

表8 天然本草類牙膏試樣中黃芩苷含量測定結果

3 討論

本研究根據黃芩苷的結構及理化性質，對提取溶劑和提取方法進行了系統考察，并結合牙膏試樣在水中分散效果較好的特點，通過實驗最終選擇50%乙醇-水溶液作為提取溶劑，為了提高牙膏在提取溶劑中的分散效果，實驗中加入了適量石英砂對牙膏進行輔助分散。同時，考慮到黃芩苷在酸性條件下的化學性質更穩定，在提取溶劑中添加6%磷酸(體積分數)使碳酸鈣基質牙膏溶解更充分，通過實驗證明，能有效提升黃芩苷的提取效率。

經反復實驗，最終確定使用Agilent Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫：0～2min(13%A)，2～18min(13%A->30%A)，18～25min(30%A)，25～28min(30%A->13%A)，28～30min(13%A)；流速1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長277nm；進樣量：10μL。結果表明，此方法條件下黃芩苷色譜峰形較理想，分離效果好，黃芩苷質量濃度在1.0μg/mL～100.0μg/mL范圍內與其峰面積呈良好的線性關系(R2= 0.9999)，將該方法應用于牙膏試樣的測定，其方法特異性、重復性、中間精密度、準確度和穩定性良好。

本次實驗針對不同基質的牙膏試樣，利用高效液相色譜法(HPLC)建立了簡便、靈敏、準確測定牙膏中黃芩苷的含量檢測方法，可作為天然本草類牙膏中黃芩苷含量的質量控制方法，在牙膏產品安全質量和應用研究領域發揮作用，更好優化研發產品，為消費者提供值得信賴的數據支持。

參考文獻(略)