淫羊藿苷通過抑制Nod樣受體家族蛋白3炎癥小體相關蛋白表達抑制BV2小膠質細胞炎癥反應

鄭層層，楊翠翠，郜 丹，郝晉萍，張 蘭，胡朝英

（首都醫科大學宣武醫院藥學部，北京市神經藥物工程研究中心，北京 100053）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種主要累及中樞神經系統（central nervous system，CNS）白質的自身免疫性疾病，以慢性炎癥浸潤、脫髓鞘以及CNS軸突和神經元丟失為主要病理特征[1]，臨床表現具有癥狀和體征的空間多發性、病程的時間多發性及復發、遷延和致殘率高等特點，多發于視神經、脊髓和腦干。目前，MS已成為致青壯年肢體殘疾的第二大誘因，給家庭和社會造成沉重的經濟和心理負擔[2-4]。MS發病初期多為復發緩解型，多以抑制炎性脫髓鞘病變進展、防止急性期病變惡化及緩解期復發為主要治療方針，有限的藥物選擇和沉重的治療負擔是治療MS面臨的兩大難題。

神經系統和免疫系統之間存在多維度的交互作用[5-6]。在MS炎癥反應早期，小膠質細胞在維持CNS免疫微環境穩態的過程中占主導地位[7]。小膠質細胞作為CNS固有免疫細胞以及聯接固有免疫和獲得性免疫的橋梁，是CNS最主要的免疫防線。對于內、外源性刺激，小膠質細胞首先被激活并分泌一系列炎癥細胞因子和神經毒性因子，這些因子可能導致鄰近神經元受損，進而引發更多小膠質細胞激活[7]。此外，小膠質細胞的低水平持續激活，持續釋放多種炎癥介質，被認為與復發緩解型MS腦和脊髓的持續慢性損傷有關[8-10]。因此，小膠質細胞是治療MS，尤其是復發緩解型MS的重要靶點。

在CNS中，Nod樣受體家族蛋白3（Nod-like receptor family protein 3，NLRP3）炎癥小體主要表達于小膠質細胞，被認為是CNS免疫炎癥反應的啟動子，是控制CNS免疫炎癥反應的新靶點[11-12]。小膠質細胞中NLRP3炎癥小體的異常過度激活可促進細胞因子白細胞介素1β（interlukin-1β，IL-1β）和IL-18的分泌并促進炎癥反應發生，引起細胞凋亡[13-15]。據報道，敲除小膠質細胞內NLRP3炎癥小體主要組成蛋白，可減輕CNS炎癥[16]。在實驗性變態反應性腦脊髓炎模型小鼠中，小膠質細胞NLRP3炎癥小體缺失可延緩MS進程，也提示NLRP3炎癥小體的激活參與MS進程[17]。

淫羊藿苷（icariin，ICA）是從淫羊藿中提取的黃酮類化合物，具有多種藥理學作用，如抗衰老、抗氧化和抗炎作用[18]，且可通過血腦屏障[19]。本課題組前期研究結果表明，ICA能夠明顯抑制MS模型小鼠小膠質細胞的過度活化，抑制炎癥因子分泌[20-21]，但其作用機制尚不明確。本研究進一步探討ICA的抗神經炎癥作用是否與其抑制NLRP3炎癥小體的形成有關。

1 材料與方法

1.1 藥物、細胞、試劑和儀器

ICA（ID：E065-N15W，批號：110737-201516，HPLC純度≥94.2%，中國食品藥品檢驗研究院）。小鼠BV2小膠質細胞（批號：3111C0001CCC00-0063，中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心）。DMEM高糖培養基、4%細胞固定液和PBS（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；青、鏈霉素混合液和ECL化學發光底物（美國Thermo Fisher公司）；細菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（美國Sigma公司）；干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）和Luminex多因子檢測試劑盒（美國R&D Systems公司）；大鼠抗人CD16/CD32單克隆抗體和兔抗人CD206多克隆抗體（美國Abcam公司）；Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG（H+L）和Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG（H+L）多克隆抗體（美國Invitrogen公司）；兔抗小鼠NLRP3單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；小鼠抗人凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）、胱天蛋白酶1（caspase 1）和胱天蛋白酶原1（procaspase 1）單克隆抗體（美國Santa公司）；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（中國Abclonal公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）和山羊抗小鼠IgG（H+L）多克隆抗體、DAPI封片劑、山羊血清和Triton X-100（北京中杉金橋公司）。Multiskan Spectrum全波長酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；Bio-Plex 200自動免疫分析儀系統（美國Bio-Rad公司）；Tanon曝光儀（上海天能科技有限公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 細胞培養、分組和藥物處理

小鼠BV2細胞用含有10%胎牛血清和1.0%青、鏈霉素混合液配制的DMEM高糖培養基于37℃、5% CO2和飽和濕度培養箱中培養。將生長良好的BV2細胞懸液以3×107L-1接種于6孔培養板，或以2×107L-1接種于放有滅菌蓋玻片的24孔板中。BV2細胞生長至約70%融合度時，用LPS聯合IFN-γ誘導BV2細胞，構建擬神經炎癥反應的小膠質細胞（microglia with analog neuroinflammation，MANF）模型。BV2細胞分為6組：細胞對照、ICA 10 μmol·L-1、模型及模型+ICA 5，10和20 μmol·L-1組。細胞對照和模型組加入DMEM高糖培養基，ICA組加入ICA 10 μmol·L-1，模型+ICA組分別加入ICA 5，10和20 μmol·L-1，孵育24 h；隨后模型和模型+ICA組加入LPS 100 μg·L-1和IFN-γ 20 μg·L-1，細胞對照和ICA組用等體積培養基代替，孵育18 h；最后模型+ICA組加入相應濃度的ICA，其他各組加入等體積培養基，繼續孵育24 h。處理結束后，吸取24孔板細胞上清進行Luminex多細胞因子檢測，固定細胞后進行免疫熒光染色；提取6孔板細胞蛋白質進行Western印跡實驗。

1.3 Luminex多細胞因子試劑盒檢測細胞培養上清中lL-3，lL-5，lL-17和單核/巨噬細胞趨化因子11（monocyte/macrophage chemokine 11，CCL11）濃度

收集1.2中24孔板細胞上清液，每組4復孔，低溫離心去除細胞顆粒備用。試劑盒平衡至室溫，按使用說明書依次向微孔板中加入樣品或標準品、蛋白微?；旌衔?、生物素-抗體檢測試劑、鏈霉親和素-PE制劑和洗滌緩沖液，室溫搖床30 min。將微孔板置于磁力架上，清洗液清洗3次，每孔加入洗滌緩沖液100 μL，使微粒重新懸浮，在搖床上培養2 min。用Bio-Plex 200自動免疫分析儀檢測細胞上清液中IL-3，IL-5，IL-17和CCL11濃度。

1.4 免疫熒光染色檢測BV2細胞M1型和M2型細胞百分比

收集1.2中24孔板細胞，每組3復孔，加4%細胞固定液室溫固定30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；采用0.5% Triton X-100磷酸鹽緩沖液（PBST）室溫透膜 20 min，PBS 洗滌 3次，每次5 min；5%山羊血清37℃封閉30 min；加入大鼠抗人CD16/CD32單克隆抗體和兔抗人CD206多克隆抗體（稀釋比1∶200）4℃孵育過夜；PBS洗滌3次，每次5 min；加Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG（H+L）或Alexa Fluor 594山羊抗兔 IgG（H+L）多克隆抗體（稀釋比1∶200）37℃孵育1 h；PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI封片劑封片，拍照。綠色熒光表示CD16/CD32陽性，即M1型BV2細胞；紅色熒光表示CD206陽性，即M2型BV2細胞。藍色表示細胞核，即總細胞數。以綠色或紅色與藍色共標的細胞數除以藍色細胞總數計算M1型或M2型BV2細胞百分比。

1.5 Western印跡法檢測BV2細胞NLRP3炎癥小體相關蛋白表達

收集1.2中6孔板細胞，每組3復孔，加入RIPA裂解液（含1%苯甲基磺酰氟和2%蛋白酶抑制劑）冰上裂解細胞，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。10%和15% SDS-PAGE凝膠電泳，恒流400 mA轉膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h，加入兔抗小鼠NLRP3蛋白（1∶1500）、小鼠抗人ASC（1∶500）、小鼠抗人胱天蛋白酶1（1∶500）和小鼠抗人GAPDH（1∶5000）單克隆抗體，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次8 min；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）和山羊抗小鼠IgG（H+L）多克隆抗體（二抗，1∶2000）室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，每次8 min，加入發光液，曝光。以待測蛋白與內參蛋白GAPDH條帶積分吸光度比值表示待測蛋白相對表達水平。

1.6 統計學分析

實驗結果數據以±s表示，采用SPSS 22和GraphPad Prism 8.0軟件進行數據處理和統計學分析。免疫熒光染色結果采用Image J軟件進行統計學分析。組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 lCA對MANF模型炎癥因子分泌的影響

如表1所示，與細胞對照組相比，ICA組細胞上清中IL-3，IL-5，IL-17和CCL11水平無明顯變化，模型組均顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+ICA 5 μmol·L-1組上述細胞因子水平無明顯變化；模型+ICA 10 μmol·L-1組除IL-5降低（P＜0.05）外，其他均無明顯變化；模型+ICA 20 μmol·L-1組上述細胞因子水平均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Effect of icariin（lCA）on secretion of interlukin-3（lL-3），lL-5，lL-17 and monocyte/macrophage chemokine 11（CCL11）in microglia with analog neuroinflammation（MANF）model

2.2 lCA對MANF模型M1和M2型細胞百分比的影響

圖1結果顯示，與細胞對照組相比，ICA組CD16/CD32和CD206陽性細胞百分比無明顯變化；模型組CD16/CD32陽性細胞百分比明顯增加（P＜0.01），CD206陽性細胞百分比顯著減少（P＜0.01），提示擬神經炎癥反應的BV2細胞向M1型炎癥表型極化。與模型組相比，模型+ICA 5 μmol·L-1組CD16/CD32陽性細胞百分比無明顯變化，CD206陽性細胞百分比明顯增加（P＜0.05）；模型+ICA 10和20 μmol·L-1組 CD16/CD32陽性細胞百分比減少（P＜0.01），CD206陽性細胞百分比顯著增多（P＜0.01），提示擬神經炎癥反應的BV2細胞向M2型極化。

Fig.1 Effect of lCA on percentage of M1 and M2 types BV2 cells of MANF model detected by immunofluorescence staining.See Tab.1 for the cell treatment.A：the representative fluorescence image of BV2 cell phenotypes，green fluorescence represents CD16/CD32 positive cells and red fluorescence represents CD206 positive cells；B1（the percentage of CD16/CD32 positive cells）and B2（the percentage of CD206 positive cells）were the semi-quantitative results of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.3 lCA對MANF模型NLRP3炎癥小體相關蛋白表達的影響

Western印跡結果（圖2）顯示，與細胞對照組相比，ICA組NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶原1蛋白表達均無明顯變化；模型組NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1蛋白表達增多（P＜0.05，P＜0.01），胱天蛋白酶原1蛋白表達明顯減少（P＜0.05）；與模型組相比，模型+ICA 5，10 和 20 μmol·L-1組NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1蛋白的表達均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），胱天蛋白酶原1表達無明顯改變。

Fig.2 Effect of lCA on protein expressions of Nod-like receptor family protein 3（NLRP3），apoptosis-associated speck-like protein（ASC），procaspase 1 and caspase 1 in MANF model detected by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.IA：integrated absorbance.B1，B2，B3 and B4 were the semi-quantitative results of A，respectively.±s，n=4.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

炎癥因子的過表達是腦炎癥損傷病理的經典特征，其中CCL11吸引免疫細胞到炎癥反應部位[22]，IL-3和IL-5刺激參與T細胞和B細胞增殖和分化[23-24]，IL-17可促使IL-6和細胞黏附分子1等炎癥因子的合成和釋放[25]，從而使炎癥反應持續。本研究用LPS聯合IFN-γ誘導BV2細胞，構建MANF模型。研究結果表明，與細胞對照組相比，細胞+ICA組細胞上清中IL-3，IL-5，IL-17和CCL11水平無明顯變化，模型組均顯著升高；ICA 20 μmol·L-1可使MANF模型細胞上述細胞因子水平明顯降低，提示ICA可抑制BV2細胞神經炎癥反應。

正常情況下，小膠質細胞處于靜息狀態。神經系統受到內在或外來炎癥損傷初期，小膠質細胞向M2型極化以發揮抗炎保護作用；隨著損傷程度加深，小膠質細胞則表現向M1型促炎表型極化，進一步加深神經系統炎癥。CD16/CD32是促炎型小膠質細胞M1型表型標志物，CD206是抑炎型小膠質細胞M2型表型標志物。本研究結果表明，與細胞對照組相比，ICA對BV2細胞CD16/CD32和CD206陽性細胞百分比無明顯影響；MANF模型組CD16/CD32陽性細胞百分比明顯增加，CD206陽性細胞百分比顯著減少，提示MANF模型細胞向M1型炎癥表型極化。與模型組相比，ICA 10和20 μmol·L-1可使MANF模型細胞CD16/CD32陽性細胞百分比明顯減少，CD206陽性細胞百分比顯著增加，表明ICA可使MANF模型細胞向M2型抗炎表型極化。

MS進程中存在NLRP3炎癥小體的激活。炎癥發生初期，小膠質細胞呈現M2型，此時NLRP3激活以抵御外界炎癥損傷，維持中樞功能平衡；疾病后期，NLRP3大量激活，M1型小膠質細胞占主導地位。NLRP3炎癥小體是以NLR3蛋白為受體蛋白、胱天蛋白酶作為效應蛋白（effector）、ASC為接頭蛋白的復合體。炎癥發生時，炎癥因子分泌增多可刺激NLRP3和ASC表達增加，使胱天蛋白酶原1轉為成熟的胱天蛋白酶1，進一步加重炎癥反應。本研究結果表明，與細胞對照組相比，ICA對BV2細胞NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶原1蛋白表達均無明顯影響；模型組NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1蛋白表達增多，胱天蛋白酶原1蛋白表達明顯減少；ICA 5，10 和 20 μmol·L-1可使 MANF模型細胞NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1蛋白表達減少，提示ICA發揮抗炎作用可能與其抑制NLRP3炎癥小體相關蛋白表達有關。

綜上所述，ICA可明顯改善LPS和IFN-γ聯合誘導的MANF模型細胞炎癥反應，有較好的抑制神經炎癥的作用。據報道，ICA可通過靶向核因子E2相關因子2信號通路抑制小膠質細胞介導的神經炎癥反應[18]。因此，需開展動物實驗研究，對ICA改善神經炎癥反應的作用機制進行深入探索。