響應面法優化-超聲輔助提取黃芪多糖工藝

魏增云， 董芳娟， 薄一覽

（1.忻州職業技術學院，山西 忻州 034000；2.忻州師范學院地理系，山西 忻州 034000）

黃芪（Radix Astragali）是豆科黃芪屬植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，是一味傳統中藥，也是保健食品的一種重要原料[1]。黃芪蘊含皂苷、黃酮、多糖等化學成分[2]，具有斂瘡生肌、利尿托毒、止汗退腫等功效[3]。黃芪多糖提取自黃芪，可溶于水[4]，是黃芪發揮生物活性和藥理作用的重要物質之一。研究證實，黃芪多糖具有抑制結直腸癌細胞的侵襲和遷移[5]、提高機體抗氧化能力、增強機體免疫力、拮抗鎘毒性[6]、保護牙周組織完整性[7]、促進重離子輻射細胞的生長、有效減輕細胞基因組DNA及染色體的損傷水平[8]等作用，因此，開發黃芪多糖的提取方法具有重要意義。

目前，黃芪多糖的提取方法主要有溶劑法、酶輔助法、微生物發酵法和電磁強化法[9]。由于工藝條件等因素，溶劑法是工業上黃芪多糖提取的常用方法，但溶劑法不僅提取率低[10]，還存在著耗時、耗能、易使活性成分失活等弊端，因此，黃芪多糖的提取方法成為黃芪多糖開發利用的瓶頸。酶輔助法對環境要求高，微生物發酵法中菌種選育困難[9]，因此不適于工業生產。電磁強化法中的超聲輔助法是利用超聲波的空化作用使溶劑滲入植物細胞，且使細胞中的有效成分快速進入溶劑。超聲波產生的擊碎效應能有效提高細胞破碎效率，加速細胞內有效成分的擴散和釋放，從而有效提高多糖提取率。超聲輔助法具有快速、低溫等特點，且有利于維持有效成分的生物活性，因此，適合于動植物多糖工業生產的研發。但超聲波強烈的機械振動也可能會破壞多糖結構。因此，本試驗擬采用低頻超聲功率，以山西省忻州市五寨縣人工種植蒙古黃芪的干燥根為原料，研究超聲輔助提取法提取黃芪多糖的工藝條件，以期為山西本地黃芪資源的高植化利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

以山西省忻州市五寨縣種植的蒙古黃芪干燥根為研究材料，購自五寨縣正和堂藥材公司；將試驗材料干燥、粉碎過40目篩，封存待用。

設備：KQ-100DB型數控超聲波設備（昆山市超聲儀器有限公司），工作頻率40 kHz，功率100 W；752N型紫外可見分光光度計（上海津科）。所用試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的制作 取7支25 mL比色管，制成2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μg·mL-1的葡萄糖標準液，然后加入5%的苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，搖勻，靜置5 min，以2 mL蒸餾水作空白對照。將此8支比色管開蓋置于沸水浴15 min后取出，冷卻至室溫，在490 nm處測量其吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標制作標準曲線，得到回歸方程為Y=0.032 0X+0.061 2，R2=0.995 9。多糖得率按照以下公式進行計算。

1.2.2 黃芪多糖的提取和測定 精確稱取0.5 g干燥的黃芪粉于50 mL三角瓶中，按液固比加一定體積的蒸餾水，超聲（超聲功率、溫度、液固比、提取時間和提取次數）提取黃芪多糖，靜置后去沉淀，定容至2 000 mL，測定黃芪多糖含量。

1.2.3 超聲輔助提取黃芪多糖工藝的優化 設置單因素試驗，分別研究超聲功率、溫度、液固比、提取時間和提取次數對黃芪多糖得率的影響。其中，超聲功率單因素試驗：溫度55℃，液固比40 mL·g-1，提取時間30 min，提取次數2次，設置超聲功率分別為20、40、60、80和100 W；溫度單因素試驗：超聲功率80 W，液固比40 mL·g-1，提取時間30 min，提取次數2次，設置溫度分別為35、45、55、65和75℃；液固比單因素試驗：超聲功率80 W，溫度55℃，提取時間30 min，提取次數2次，設置液固比分別為20、30、40、50和60 mL·g-1；提取時間單因素試驗：超聲功率80 W，溫度55℃，液固比50 mL·g-1，提取次數2次，設置提取時間分別為10、20、30、40和50 min；提取次數單因素試驗：超聲功率80 W，溫度55℃，液固比50 mL·g-1，提取時間20 min，設置提取次數分別為1、2和3次。

1.2.4 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上，選擇對黃芪多糖提取有顯著影響的因素：超聲功率、溫度、液固比和提取時間4個因素為考察對象，以黃芪多糖得率為響應值，采用Design-Expert 8.0.6 Trial統計分析方法，設計四因素三水平回歸試驗（表1）。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Analytical factors and levels for response surface methodology

2 結果與分析

2.1 超聲輔助提取黃芪多糖工藝的優化

超聲功率、溫度、液固比、提取時間和提取次數5個因素對黃芪多糖的提取率有顯著影響（表2）。不同超聲功率、溫度、液固比、提取時間所得的多糖得率存在極顯著差異；不同提取次數所得的多糖得率差異顯著。隨著功率的增加，黃芪多糖得率先增加后降低，功率為80 W時黃芪多糖得率最高，可能是由于功率過大破壞了多糖結構[11]，因此，80 W為黃芪多糖超聲提取的最佳功率。隨著提取溫度的升高，黃芪多糖得率也呈先升高后降低趨勢，當提取溫度為55℃時黃芪多糖得率最高，溫度繼續升高后多糖得率顯著降低，可能是由于溫度過高導致多糖降解[12]，因此，55℃為黃芪多糖超聲提取的最佳提取溫度。隨著液固比的增加，黃芪多糖得率先升高后降低，液固比為50 mL·g-1時多糖得率最高。隨著提取時間的增加，黃芪多糖得率先升高后降低，在提取時間為20 min時最高，繼續延長時間，多糖得率反而降低，30 min后下降更為明顯，這可能是由于處理時間太長，超聲波使黃芪多糖發生斷裂[13]，因此，20 min為最佳提取時間。隨提取次數的增加，黃芪多糖得率逐漸增加，提取次數為3次時，黃芪多糖得率最高，但提取次數為2次和3次間多糖得率差異不顯著，且提取3次時成本太高，因此，提取次數為2次最佳。

表2 不同處理下的黃芪多糖得率Table 2 Yield of astragalus polysaccharides under different treatments

2.2 響應面分析

2.2.1 回歸分析 根據表1設計的因素及水平，按表3方案實施試驗，共24個析因點，5次零點試驗，得出各個試驗條件的黃芪多糖得率。不同試驗條件所得黃芪多糖得率差異極顯著（F=31.81，P＜0.01）。軟件經無量綱線性編碼代換模擬出回歸方程。

表3 響應面分析Table3 Analysis of response surface methodology

式中，A代表超聲功率；B代表溫度；C代表液固比；D代表提取時間。由此表明，超聲功率、溫度、液固比和提取時間4因素對黃芪多糖得率的影響依次為：超聲功率＞溫度＞液固比＞提取時間。

2.2.2 方差分析 方差分析（表4）表明，模型的F值為15.35，P＜0.000 1，表明該回歸方程的擬合度良好。A、B、A2、B2、C2和D2的P值均小于0.05，說明模型項顯著。失擬項的F值為31.99，表明模型適合度顯著。模型調整后的相關系數R2為0.877 7，變異系數為2.53%，表明試驗的可靠性高，實驗操作可靠。該模型的確定系數R2為0.938 8，表明多糖得率的實測值與預測值間的擬合度較好，該模型可用于黃芪多糖得率的預測。

2.2.3 響應面分析 為了更明確超聲功率、溫度、液固比、提取時間對黃芪多糖得率的交互關系，采用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對表4數據進行多元回歸分析，結果（圖1）表明，超聲功率與溫度和提取時間交互作用不顯著；溫度與液固比和提取時間交互作用顯著。因此，經過中心組合設計對提取條件進行優化，超聲輔助提取法提取黃芪多糖工藝的最佳提取參數為：超聲功率80.3 W，溫度56.1 ℃，液固比49.02 mL g-1，提取時間20.8 min，此時多糖得率可達到5.468%。驗證性試驗（超聲功率80 W，溫度55℃，液固比50 mL·g-1，提取時間20 min）表明，黃芪多糖得率為5.40%，與理論值相符。因此，采用響應面法得到的提取條件相對可靠，具有一定的應用價值。

圖1 不同影響因素對黃芪多糖得率的交互關系Fig.1 Interaction relation of different influencing factors on the yield of astragalus polysaccharides

表4 擬合二次多項式模型的方差分析Table 4 Variance analysis of fitting quadratic polynomial model

3 討論

黃芪多糖是黃芪中的有效活性成分[5-8]，將黃芪多糖開發為藥物或保健產品逐漸成為一種研究趨勢。本研究對黃芪多糖的超聲輔助提取工藝進行了優化，結果表明，超聲功率、反應溫度和提取時間都不宜過高，超過一定閾值可能會破壞黃芪多糖結構而使得多糖得率降低，與前人研究結果一致[11-13]；液固比增大，多糖得率也隨之升高，可能是由于細胞內外濃度梯度的增大有利于細胞內多糖的析出，但液固比高于50 mL·g-1后，多糖得率反而降低。進一步利用響應面優化法研究超聲功率、反應溫度、液固比和提取時間對黃芪多糖得率影響的強弱關系表明，超聲功率＞溫度＞液固比＞提取時間；因素間的互作表明，超聲功率與溫度和提取時間交互作用不顯著，溫度與液固比和提取時間交互作用顯著。因此，超聲輔助提取黃芪多糖工藝最佳提取條件為：超聲功率80 W，溫度55 ℃，液固比50 mL·g-1，提取20 min。按照此條件進行提取，山西五寨人工種植黃芪的多糖得率可達5.40%。梁子敬等[14]研究表明，超聲輔助提取黃芪多糖的適宜參數為：功率600 W，溫度80 ℃，液固比22 mL·g-1，提取87 min，黃芪多糖得率為6.07%。與其相比，本研究采用低頻超聲波，節能的同時更有效地減少了噪聲污染，且提取時間更短，反應溫度更易控制，液固比較高，可能是由于較高的液固比增加了細胞內外濃度差，更有利于多糖的析出。本試驗用時僅為水提工藝[15]的33%、堿水提工藝[10]的4.44%，顯著縮短了提取時間；相較超聲輔助堿水提取法[2]和微波輔助提取法[16]，操作簡單易控，不用預處理及控制pH，無廢渣廢液，節能環保。