基于熒光探針技術檢測30 種農獸藥及其二元、三元組合對CYP3A4 酶的聯合毒性

朱新月, 陳立森, 何深貴, 趙 鑫, 程林麗, 崔京南*,

(1. 大連理工大學 精細化工國家重點實驗，遼寧 大連 116000；2. 中國農業大學 動物醫學院，北京 100193)

科學合理的農藥或獸藥混用，解決了農業生產中農獸藥單劑存在的防治范圍窄、防治效果低、易產生抗藥性、成本高等問題[1]，但同時也導致生鮮食品中多種低殘留農獸藥污染物共存現象顯著增加[2-4]，隨之產生的聯合毒性在遺傳、神經、免疫系統、生殖和發育等方面對生物體產生了嚴重不良影響[5-6]。目前國內外對農獸藥聯合效應的研究資料相對較少，關于大批量二元和三元農獸藥組合的研究更少。Kang 等[7]通過檢測韓國養殖場中958 個魚類樣本的獸藥殘留發現，87 個樣本檢測到2 種及以上獸藥殘留，其中恩諾沙星和環丙沙星最常被檢測到。馬晨等[8]于2017—2019 年通過分析海南省主產區178 份芒果樣品發現， 71.91%的樣品同時含有2 種及以上的農藥殘留，最多同時檢出8 種農藥殘留。研究發現，農獸藥的聯合毒性效應主要有加和性、協同性和拮抗性3 種類型[9]。Luan 等[10]研究了恩諾沙星與粘菌素和喹諾酮2 種獸用抗菌藥物聯用對大鼠肝臟的毒理學作用，結果表明3 種獸藥混合使用后聯合毒性顯著增強；Cheng 等[11]評估了3 種新煙堿類農藥混合物對人神經母細胞瘤SK-N-SH 和鱗翅類Sf-9 細胞的聯合毒性，發現隨著農藥濃度或農藥組合的變化，聯合毒性呈現協同作用或者拮抗作用。這種聯合毒性效應的不確定性對農獸藥混劑的安全性構成潛在威脅。因此，相對于單元農獸藥殘留超標現象，多種農獸藥殘留對人體健康的聯合毒性的研究同樣需要引起重視。

利用發光細菌[12-13]、活細胞[14-15]或者生物體[16-17]作為靶標檢測農獸藥毒性，存在培育過程繁瑣、實驗周期較長、不適合大批量測試等問題。酶抑制法作為農獸藥毒性檢測方法之一，因具有成本低、操作方便、檢測快速、高通量等特點，為篩查和監測多種混合農獸藥聯合毒性提供了新的思路[18]。CYP3A4 酶又稱細胞色素P450 3A4 酶，是酶抑制法常用酶之一，主要存在于肝臟和小腸中，可以氧化外源性有機小分子 (如毒素或藥物)，并參與環境致癌物的生物活化，它的表達受多種刺激的影響，包括殺蟲劑和殺菌劑等環境因素。CYP3A4 酶在睪酮 (2β-、6β-或15β-羥基睪酮) 和雌激素 (4- 或16α-羥基雌酮) 的氧化中具有重要影響[19-20]，其個體差異可通過調節性激素代謝物水平在乳腺癌和前列腺癌的發生中起作用[21]，因此以CYP3A4 酶作為毒物毒性的生物學標志已廣泛應用于毒理學研究。傳統的CYP3A4 酶活性檢測方法主要依賴于質譜法和高效液相色譜法[22-23]，設備復雜昂貴、操作過程繁瑣耗時。近年來，熒光探針技術因其靈敏度高、選擇性強等特點，已逐步應用于生物體內酶活性檢測領域[24-25]，但是利用熒光探針檢測混合農獸藥的聯合毒性效應還鮮有報道。

Ning 等[26]通過采用二維分子設計策略，成功開發出首個用于選擇性檢測CYP3A4 酶的熒光探針NEN (N-乙基-1,8-萘二甲酰亞胺)，為體外和體內內源性CYP3A4 酶活性的定量表征提供了新方法。本研究基于酶抑制法原理，將熒光探針NEN檢測CYP3A4 酶活性方法進一步應用于農獸藥毒性檢測領域，建立廣譜性篩查混合農獸藥聯合毒性效應的方法，并以常用的30 種農獸藥及其典型的23 種二元和26 種三元組合為研究對象，檢測農獸藥混合物對CYP3A4 酶的聯合毒性，通過比較單元與多元混合農獸藥對CYP3A4 酶活性抑制率的變化程度，探究混合農獸藥各組分之間的聯合毒性效應，并進一步分析農獸藥與CYP3A4 酶之間的構效關系，旨在為今后在細胞和動物水平制訂農獸藥混劑的風險評估方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

30 種農獸藥標準品，購于北京萬佳首化生物科技有限公司，并在 ?10 ℃以下保存；混合人肝微粒體 (HLM)，購于上海瑞德肝臟疾病研究有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，購自薩恩化學技術上海有限公司安耐吉化學；葡萄糖-6-磷酸二鈉 (G-6-P) 、葡萄糖-6 磷酸脫氫酶 (B 液) 和β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉 (NADP+) ，購買于Sigma 公司；其他試劑均為市售色譜純級別。

Scientific Sorvall WX 低溫超速離心機 (美國Thermo 公司)；MS104S 分析天平 (瑞士Mettler toledo 公司)；MSC-100 恒溫混勻儀 (上海金新實業有限公司)；PHS-3C pH 計 (上海儀電有限公司)；Research plus 移液槍 (德國Eppendorf 公司)；VORTEX-5 旋渦混合器 (海門其林貝爾儀器制造有限公司)；Bio-Tek Synergy H1 全功能酶標儀 (美國BioTek 公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 探針NEN 的合成表征及發光機理 根據Ning 等[26]報道的方法合成了CYP3A4 酶的高選擇性探針底物NEN (結構式見圖1)，乳白色固體，產率為63%。1H NMR(500 MHz, CDCl3),δ:8.65～8.58 (m, 2H), 8.21 (d,J= 8.3 Hz, 2H), 7.79～7.73 (m, 2H), 4.26 (q,J= 7.1 Hz, 2H), 1.34 (t,J=7.1 Hz, 3H).

圖1 NEN 對CYP3A4 酶的熒光響應機制Fig. 1 The fluorescence response mechanism of the probe NEN toward CYP3A4

NEN 對CYP3A4 酶的熒光響應機制如圖1 所示[26]，NEN 在CYP3A4 酶催化作用下羥基化，生成N-乙基-4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺 (NEHN)，NEHN 的4 位酚羥基在生理條件下 (pH = 7.4) 轉變為氧負離子，得到N-乙基-4-氧負基-1,8-萘二甲酰亞胺(NEON)，使得供電子能力增大，發射熒光強度增強，在465 nm 激發光照射下，發射558 nm熒光。

1.2.2 農獸藥標準質量濃度的設定 以食品安全國家標準(GB 2763—2021、GB 31650—2019)[27-28]規定的食品中農獸藥最大殘留量作為農獸藥測試的標準質量濃度，設定0.5、1.0 和3.0 倍標準質量濃度3 個梯度，并將農獸藥殘留量單位由mg/kg轉變成mg/L；同時參考食品中農獸藥殘留的檢出限和農獸藥急性中毒的參考劑量，最終確定混合農獸藥聯合毒性測試的標準質量濃度。30 種農獸藥的編號、結構式、標準質量濃度及抑制率如表1所示。

表1 30 種農獸藥的編號、結構式、標準質量濃度及抑制率Table 1 The number, structural formula, standard mass concentration and inhibition rate of 30 pesticides and veterinary drugs

1.2.3 酶活性檢測 CYP3A4 酶活性的測定體系：孵育體系的總體積200 μL，其中包括：NADPH生成系統 (1 mmol/L NADP+、10 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸、1 Unit/mL 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、4 mmol/L MgCl2和HLM (終濃度為10 μg/mL)，其余為PBS緩沖溶液 (100 mmol/L，pH = 7.4)。篩選實驗分為2 組：對照組和抑制劑組，其中抑制劑組加入不同質量濃度的農獸藥或者不同配比條件的農獸藥混合物，對照組以等體積的空白溶劑二甲基亞砜(DMSO)代替農獸藥。抑制劑或空白溶劑分別與探針底物NEN (終濃度為50 μmol/L) 在HLM 存在的體系中，于37 ℃ 孵育鍋中預孵3 min，隨后加入NADP+作為輔因子起始反應；反應30 min 后加入100 μL 冰乙腈沉淀蛋白終止反應。然后在4 ℃、13423 r/min 條件下離心10 min，取上清液于全功能酶標儀中進行熒光分析。激發波長設置為465 nm，發射信號波長采集為476～700 nm。最后通過對比對照組和抑制劑組在560 nm 發射波長下的熒光強度求算不同農獸藥及組合對CYP3A4 酶活性的抑制率，每組樣品設置3 個平行，得到平均熒光強度。按 (1) 式計算每種農獸藥或者農獸藥組合對CYP3A4 酶活性的抑制率(R)。

式中：A0為對照組平均熒光強度，A1為抑制劑組平均熒光強度。

1.2.4 基于效應相加模型評估聯合毒性效應 效應相加模型 (effect summation, ES) 廣泛應用于評價混合物聯合毒性，該模型認為混合物的總效應是混合物各個組分效應之和，一般應用于化合物濃度-效應曲線(concentration-response curve，CRC)呈良好線性關系時[29]。

在測得農獸藥單劑對CYP3A4 酶的抑制率后，根據ES 模型計算出二元和三元組合在相應質量濃度梯度下抑制率的加和值，二元和三元組合在各質量濃度梯度下的實測抑制率為相應梯度下2 種農獸藥混合后測試得到的抑制率，差值等于實測抑制率減去抑制率的加和值。當差值大于零時，表明該二元或三元組合各組分之間具有協同作用；當差值小于零時，則表明具有拮抗作用。

1.3 數據處理

本研究用ChemDraw 軟件繪制農獸藥結構式，用 Origin 9.1 和 Excel 軟件處理數據和繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 30 種農獸藥單劑對CYP3A4 酶的毒性測定

結果(圖2)顯示：除對CYP3A4 酶活性無抑制作用的農獸藥外，其他農獸藥的濃度-抑制率曲線均呈良好的線性關系，故能夠應用ES 模型探究本研究的聯合毒性效應。

圖2 30 種農獸藥在3 種質量濃度梯度下對CYP3A4 酶活性的抑制率Fig. 2 The inhibition rate of 30 pesticides and veterinary drugs on CYP3A4 activity under three mass concentration gradients

在設定的標準質量濃度范圍內，毒死蜱、咪鮮胺和噠螨靈對CYP3A4 酶的毒性最大，0.5 倍標準質量濃度即可達30% 以上的抑制率，分別為50.1%、42.2% 和32.6%，當超過最大殘留量至3 倍標準質量濃度時，可分別達84.0%、73.2%和54.9%的抑制率；苯醚甲環唑、百菌清、甲基毒死蜱和氯氰菊酯對CYP3A4 酶的毒性次之，標準質量濃度下的抑制率分別為36.5%、35.6%、33.1%和28.3%；呋喃妥因、聯苯菊酯、烯酰嗎啉、異菌脲和蟲螨腈對CYP3A4酶的毒性較強，標準質量濃度下的抑制率在10%～20%范圍內；奧硝唑、高效氯氟氰菊酯、樂果、氟苯尼考和吡蟲啉對CYP3A4 酶的毒性較弱，標準質量濃度時的抑制率在10%以下，0.5 倍標準質量濃度時在5%以下；乙酰甲喹、土霉素、多菌靈、環丙沙星、氧化樂果、克百威、恩諾沙星、速滅威、甲胺磷、替硝唑、呋喃它酮、氰戊菊酯和啶蟲脒對CYP3A4酶的活性無抑制作用，在標準質量濃度和0.5 倍標準質量濃度下的抑制率均為負值。

2.2 23 種典型的農獸藥二元組合對CYP3A4 酶聯合毒性的測定

23 種典型的農獸藥二元組合在3 個質量濃度梯度下對CYP3A4 酶的聯合毒性測試結果如圖3所示，3 個質量濃度梯度下均為協同作用的共有4 個組合，其中克百威 + 多菌靈 (6 + 18)、克百威 +吡蟲啉 (6 + 17)、啶蟲脒 + 烯酰嗎啉 (16 + 20) 在標準質量濃度下的協同作用分別為22.5%、20.7%和15.1%，吡蟲啉 + 多菌靈 (17 + 18) 在3 倍標準質量濃度下協同作用為10.7%。多菌靈 + 咪鮮胺(18 + 19)、多菌靈 + 苯醚甲環唑 (18 + 21)、克百威 + 啶蟲脒 (6 + 16)、克百威 + 毒死蜱 (6 + 2)、恩諾沙星 + 環丙沙星 (27 + 26) 及恩諾沙星 + 土霉素(27 + 30) 等6 組組合，在標準質量濃度和3 倍標準質量濃度時具有協同作用，分別最高達9.6%、7.0%、4.7%、10.4%、3.6%及7.2%；毒死蜱 + 多菌靈 (2 + 18) 在標準質量濃度時有2.5%的協同作用，啶蟲脒 + 多菌靈 (16 + 18) 在3 倍標準質量濃度時有5.9%的協同作用。

圖3 23 種典型的農獸藥二元組合分別在3 倍標準質量濃度 (a) 、標準質量濃度 (b) 、0.5 倍標準質量濃度梯度 (c)下對CYP3A4 酶活性的抑制率實測值、加和計算值及差值柱狀圖(注：圖中編號參照表1)Fig. 3 The histograms of inhibition rate of 23 typical pesticide and veterinary drug binary combinations on CYP3A4 activity under 3 times standard mass concentration (a), standard mass concentration (b), and 0.5 times standard mass concentration (c), respectively(Note: The number of each pesticide and veterinary drug refer to Table 1)

3 個質量濃度梯度下均為拮抗作用的農獸藥共9 個組合，其中毒死蜱 + 咪鮮胺 (2 + 19)、啶蟲脒 + 噠螨靈 (16 + 12) 及苯醚甲環唑 + 烯酰嗎啉(21 + 20) 的拮抗作用最為顯著，均在3 倍標準質量濃度時達到最高，分別為64.6%、44.7%和28.2%；恩諾沙星 + 氟苯尼考 (27 + 22)、環丙沙星 + 氟苯尼考 (26 + 22)、聯苯菊酯 + 啶蟲脒 (8 + 16) 及吡蟲啉 + 苯醚甲環唑 (17 + 21) 的拮抗作用較為明顯，在0.5 倍標準質量濃度時，分別為27.5%、19.9%、18.6%和18.6%；吡蟲啉 + 烯酰嗎啉 (17 +20) 及樂果 + 烯酰嗎啉 (4 + 20) 的拮抗作用較弱，均在5%以下。氯氰菊酯 + 烯酰嗎啉 (10 + 20) 及毒死蜱 + 高效氯氟氰菊酯 (2 + 11) 在標準質量濃度和0.5 倍標準質量濃度時的協同或拮抗作用較弱，而3 倍標準質量濃度時有較強的拮抗作用，分別為25.8%及18.2%。

通過對比具有協同作用的組合可以看出，克百威或多菌靈單獨作用于CYP3A4 酶時，無活性抑制作用，吡蟲啉的抑制率也較低，這3 個農藥的兩兩組合對CYP3A4 酶顯示出10%～20%的抑制率，協同作用明顯。所有含有克百威或多菌靈的二元組合，對CYP3A4 酶毒性均具有增強現象，協同作用最高可達20.7%。

2.3 26 種典型的農獸藥三元組合對CYP3A4 酶聯合毒性的測定

測定結果如圖4 所示：大部分組合的聯合毒性呈拮抗作用，3 種質量濃度梯度下均為協同作用的只有6 個組合，所占比例為23.1%。其中氯氰菊酯 + 啶蟲脒 + 烯酰嗎啉 (10 + 16 + 20)、克百威 +啶蟲脒 + 多菌靈 (6 + 16 + 18) 的協同作用最為顯著，分別為29.9%和21.6%；吡蟲啉 + 啶蟲脒 +多菌靈 (17 + 16 + 18)、吡蟲啉 + 啶蟲脒 + 烯酰嗎啉 (17 + 16 + 20)、毒死蜱 + 啶蟲脒 + 多菌靈 (2 +16 + 18)、聯苯菊酯 + 啶蟲脒 + 多菌靈 (8 + 16 +18) 4 種組合的協同作用較為顯著，分別最高達15.4%、12.8%、12.1%和7.3%。氯氰菊酯 + 吡蟲啉 + 烯酰嗎啉 (10 + 17 + 20)、啶蟲脒 + 噠螨靈 +蟲螨腈 (16 + 12 + 13) 2 個組合在標準質量濃度和0.5 倍標準質量濃度時的協同作用為5.3%和10.5%；恩諾沙星 + 環丙沙星 + 土霉素 (27 + 26 + 30) 組合在3 倍標準質量濃度和標準質量濃度時的協同作用達到7.5%；吡蟲啉 + 多菌靈 + 苯醚甲環唑 (17 +18 + 21) 組合在3 倍標準質量濃度下具有17.3%的協同作用；吡蟲啉 + 異菌脲 + 烯酰嗎啉 (17 + 15 +20) 組合在0.5 倍標準質量濃度下顯示4.1%協同作用。

圖4 26 種典型的農獸藥三元組合分別在3 倍標準質量濃度 (a) 、標準質量濃度 (b) 、0.5 倍標準質量濃度梯度 (c)下對CYP3A4 酶活性的抑制率實測值、加和計算值及差值柱狀圖(注：圖中編號參照表1)Fig. 4 The histograms of inhibition rate of 26 typical pesticide and veterinary drug ternary combinations on CYP3A4 activity under 3 times standard mass concentration (a), standard mass concentration (b) and 0.5 times standard mass concentration (c) respectively(Note: The number of each pesticide and veterinary drug refer to Table 1)

3 種質量濃度梯度下均為拮抗作用的農獸藥組合共15 種，所占比例為57.7%。其中多菌靈 + 毒死蜱 + 咪鮮胺 (18 + 2 + 19)、氯氰菊酯 + 苯醚甲環唑 + 烯酰嗎啉 (10 + 21 + 20)、苯醚甲環唑 + 多菌靈 + 毒死蜱 (21 + 18 + 2)、苯醚甲環唑 + 多菌靈 +氯氰菊酯 (21 + 18 + 10) 和多菌靈 + 毒死蜱 + 氯氰菊酯 (18 + 2 + 10) 5 種組合的拮抗最為顯著，最高均可達50%以上，分別為73.5%、73.4%、71.2%、61.2%和56.2%；高效氯氟氰菊酯 + 苯醚甲環唑 +烯酰嗎啉 (11 + 21 + 20)、吡蟲啉 + 苯醚甲環唑 +烯酰嗎啉 (17 + 21 + 20)、氯氰菊酯 + 啶蟲脒 +噠螨靈 (10 + 15 + 12) 和多菌靈 + 毒死蜱 + 高效氯氟氰菊酯 (18 + 2 + 11) 4 種組合的拮抗作用比較明顯，最高均可達30%以上，分別為42.3%、41.6%、37.6%、30.1%；恩諾沙星 + 環丙沙星 + 氟苯尼考(27 + 26 + 22)、多菌靈 + 毒死蜱 + 吡蟲啉 (18 + 2 +17)、啶蟲脒 + 噠螨靈 + 烯酰嗎啉 (16 + 12 + 13)和吡蟲啉 + 啶蟲脒 + 苯醚甲環唑 (17 + 16 + 21) 4 種組合的拮抗作用較強，最高均在10%以上，分別為24.5%、16.5%、14.6%和18.1%；克百威 + 毒死蜱 + 多菌靈 (6 + 2 + 18)、聯苯菊酯 + 啶蟲脒 +蟲螨腈 (8 + 16 + 13) 2 種組合的拮抗作用較弱，均在5%以下。

通過對比具有協同作用的組合可以看出，所有含有啶蟲脒 + 多菌靈 (16 + 18) 的三元組合在3 種質量濃度梯度下對CYP3A4 酶均具有毒性增強現象，協同作用最高達21.6%。對比具有拮抗作用的組合可以發現，除了吡蟲啉 + 多菌靈 + 苯醚甲環唑 (17 + 18 + 21) 在3 倍標準質量濃度下具有協同作用外，所有存在苯醚甲環唑 (21) 的組合在3 種質量濃度梯度下均存在毒性降低現象，拮抗作用最高達73.4%。

3 討論

在單一農獸藥對CYP3A4 酶活性抑制率的測試中，毒死蜱、咪鮮胺和噠螨靈對CYP3A4 酶的毒性最大，在0.5 倍設定的標準質量濃度即可分別達50.1%、42.2%和32.6%的抑制率，應慎重使用這3 種農藥，以減少潛在的風險。在二元農獸藥組合對CYP3A4 酶的聯合毒性測試中，3 種質量濃度梯度下均為拮抗作用的組合共9 種，均為協同作用的共4 種，其中毒死蜱 + 高效氯氟氰菊酯組合的拮抗作用和克百威 + 多菌靈的協同作用與李靜等[30]的測試結果相似，毒死蜱 + 克百威組合的協同作用與茍練等[31]的測試結果相似，苯醚甲環唑 + 烯酰嗎啉、氯氰菊酯 + 烯酰嗎啉2 個組合的拮抗作用與王天彩等[32]在低效應下的測試結果相似，啶蟲脒、多菌靈和克百威3 種農獸藥任意兩兩混合時存在毒性增強現象與王昕璐[33]的測試結果相似。在三元農獸藥組合對CYP3A4 酶的聯合毒性的測試中，3 種質量濃度梯度下聯合毒性均為拮抗作用的組合共15 組，均為協同作用的組合共6 組，其中氯氰菊酯 + 啶蟲脒 + 烯酰嗎啉組合的協同作用與王天彩等[32]在低毒性效應區的測試結果相似。在已報道的文獻中，關于農獸藥三元組合聯合毒性的測試實例較少，應作為今后研究重點。

農獸藥的毒性與其化學結構之間存在著密切關系。研究農獸藥化學結構及其毒性效應之間的關系，找出其規律，在毒理學研究中具有重要意義。基于單一農獸藥與CYP3A4酶之間的構效關系分析，具有3 個芳氯基團的農獸藥對CYP3A4酶活性的抑制作用最為顯著，如百菌清、毒死蜱、甲基毒死蜱及咪鮮胺的抑制率在標準質量濃度時均達30%以上；具有2 個芳氯或“強吸電子基團 + 1 個芳氯基團”的農獸藥對CYP3A4 酶活性的抑制作用較為顯著，如苯醚甲環唑、噠螨靈和異菌脲的抑制率在標準質量濃度時均達18% 以上。WANG 等[34]在檢測氯代甲烷對小麥葉綠素和土壤呼吸率的影響時同樣發現，甲烷中氫原子被取代的越多，其毒性越大。這些研究結果表明農獸藥毒性與鹵代烴類鹵素數之間可能具有一定的聯系。

從農獸藥多元組合對CYP3A4 酶的聯合毒性的測試結果中可以看出：含有氨基甲酸酯結構的農獸藥在本身對CYP3A4 酶毒性較小或幾乎沒有毒性時，與其他農獸藥混合后存在較強的協同作用，如克百威和多菌靈單劑對CYP3A4 酶活性無抑制作用，而所有含有克百威或多菌靈的二元組合均存在較強的協同作用。有研究表明，含有氨基甲酸酯結構的農獸藥具有較強的增效作用[35-36]，這可能是由于農獸藥混合后，含有氨基甲酸酯結構的農獸藥對酶具有激活作用或者可以防止與其混配的農獸藥失活，從而使混合農獸藥對酶活性的抑制效果增強，進而毒性增強所致。

當農獸藥單劑對CYP3A4 酶活性的抑制率較高時，如苯醚甲環唑、咪鮮胺、毒死蜱等，與其他農獸藥混合后聯合效應呈拮抗作用；當農獸藥單劑對CYP3A4 酶活性抑制率低于2%時，與其他農獸藥混合后的聯合毒性效應呈現不確定性，如啶蟲脒、吡蟲啉和恩諾沙星等農獸藥與其他農獸藥混合后，協同或拮抗作用均有存在。農獸藥單劑在對CYP3A4 酶活性抑制率較高或較低時，其聯合毒性效應呈現不同的情況，分析其原因可能是這些農獸藥在以CYP3A4 酶為作用靶點時，其作用機制相似或相互影響，當某種農獸藥對CYP3A4 酶活性抑制作用較強時，會影響甚至削弱其他農獸藥對CYP3A4 酶的作用，從而產生更弱的毒性；而當某種農獸藥對CYP3A4 酶活性抑制率較低時，作用機制之間的影響較弱或可以忽略不計，從而放大農獸藥自身結構、理化性質、混合農獸藥各組分之間的相互作用以及其他因素的影響，使得聯合毒性效應呈現不確定性。從農獸藥的濃度變化趨勢可以看出，混合農獸藥在低濃度下對CYP3A4 酶活性抑制率往往存在較強的毒性協同作用，但隨著濃度的升高，聯合毒性效應從協同變為拮抗作用。Nong 等[37]在檢測抗生素與三唑類殺菌劑混合物對羊角月牙藻的聯合毒性時同樣發現，同一混合物在較高濃度區域呈拮抗作用，而在低濃度區域呈現協同作用。本研究中聯合毒性效應顯示隨濃度變化而不同的原因可能是：低濃度下農獸藥共同作用于同一位點，隨著濃度的升高，混合農獸藥中起決定作用的組分在對CYP3A4 酶的活性抑制過程中出現了不同的毒性效應或者類似競爭作用位點的可結合性降低，即“競爭性拮抗作用”[38]。

4 結論

本研究依據熒光探針技術和酶抑制法原理，建立了一種方便、快捷、高效的廣譜篩查混合農獸藥聯合毒性效應的方法，探究了常用的30 種農獸藥及其部分二元、三元組合在標準質量濃度、0.5 倍及3 倍標準質量濃度下的對CYP3A4 酶的聯合毒性效應。農獸藥結構中含有芳氯基團的數量與對CYP3A4 酶活性的抑制程度成正相關，含有芳氯基團越多對CYP3A4 酶的毒性越強。含有氨基甲酸酯結構的農獸藥（包括克百威和多菌靈）在本身對CYP3A4 酶的毒性較小或幾乎沒有毒性時，與其他農獸藥混合后顯示較強的協同作用，在今后配制農獸藥混劑時應慎重使用，以減少潛在風險。混合農藥或獸藥在低濃度下對CYP3A4酶往往存在較強的毒性協同作用，隨著濃度的升高，聯合毒性效應從協同變為拮抗作用。農獸藥單劑對CYP3A4 酶活性的抑制率較高時，與其他農獸藥混合后聯合效應呈拮抗作用的組合較多；農獸藥單劑對酶抑制率低于2%時，與其他農獸藥混合后的聯合毒性效應呈現不確定性。本研究建立的檢測方法為廣譜篩查混合農獸藥聯合毒性提供了新的思路，檢測結果可為進一步在細胞和動物水平的農獸藥混劑的風險評估方案設計提供依據。