番茄紅素對IL-1β誘導軟骨細胞炎性損傷的抑制作用

呂 靜， 崔宇煒， 張 英

(鄭州衛生健康職業學院，河南 鄭州 450005)

骨關節炎是臨床常見的一種慢性關節疾病，研究顯示軟骨細胞凋亡是造成骨關節炎發生的重要原因之一，而微小RNA(miRNA)可調控軟骨細胞增殖及凋亡等生物學過程從而參與骨關節炎發生及發展[1-3]，如何抑制軟骨細胞凋亡成為了研究熱點。目前臨床常用的骨關節炎治療藥物(非甾體類抗炎藥)存在較多副作用，天然植物化學物質具有安全、有效等優點，可為治療骨關節炎等炎癥性疾病提供新方向[4]。番茄紅素可抑制氧化應激反應從而對帕金森小鼠的神經元發揮保護作用[5]，但番茄紅素對軟骨細胞損傷的作用機制尚未完全闡明。微小RNA-374a-5p(miR-374a-5p)表達升高可抑制新生兒缺氧缺血性腦病的神經系統炎癥反應[6]，然而番茄紅素是否通過miR-374a-5p影響白細胞介素(IL)-1β誘導的軟骨細胞炎性損傷尚未明確。因此，本研究旨在探討番茄紅素在IL-1β刺激的軟骨細胞損傷模型中的調節作用和機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠10只，體質量180～220 g，購自南京卡文斯生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(寧)2016-0008。

1.2 試劑與藥物 番茄紅素購自晨光生物科技集團股份有限公司(純度96%，批號20180623)。IL-1β購自上海江萊生物科技有限公司；IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)所需試劑盒購自廈門安普利生物工程有限公司；miR-374a-5p寡核苷酸模擬物(miR-374a-5pmimics)、陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-374a-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-374a-5p)、其陰性對照(anti-miR-NC)購自廣州銳博生物技術有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax抗體購自美國Santa Cruz公司。

2 方法

2.1 膝關節軟骨細胞培養與分離 按照文獻[7]報道，將10只大鼠置于75%乙醇中浸泡3 min，取出關節軟骨，放入PBS溶液中洗滌4次，置于含有青霉素的小瓶中，加入Ⅱ型膠原酶溶液，剪切組織呈1 mm3碎片，置于37 ℃水浴鍋內消化30 min，棄懸浮液，加入DMEM漂洗2次，棄上清，加入10倍量Ⅱ型膠原酶溶液，37 ℃水浴鍋內消化30 min，收集上懸液，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，PBS清洗并加入DMEM懸浮細胞，將分離的軟骨細胞置于25 cm2培養皿進行培養。以第3代細胞為實驗對象。

2.2 分組及給藥 在96孔板每孔中接種100 μL對數生長期軟骨細胞(密度為1×105/mL)，隨機分為對照組(常規培養基)、IL-1β組(10 ng/mL IL-1β)[8]和IL-1β+番茄紅素低、中、高劑量組(10 ng/mL IL-1β+2.5、5、10 μmol/L番茄紅素)[9]，培養24 h。后續實驗設置IL-1β+miR-NC組(10 ng/mL IL-1β+轉染miR-NC)、IL-1β+miR-374a-5p組(10 ng/mL IL-1β+轉染miR-374a-5pmimics)及IL-1β+番茄紅素+anti-miR-NC組(10 ng/mL IL-1β+10 μmol/L番茄紅素+轉染anti-miR-NC)、IL-1β+番茄紅素+anti-miR-374a-5p組(10 ng/mL IL-1β+10 μmol/L番茄紅素+轉染anti-miR-374a-5p)，培養24 h。

2.3 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測細胞上清液IL-6、TNF-α、IFN-γ水平 按“2.2”項下方法分組及給藥，培養24 h后收集細胞及其培養液，4 ℃、3 000 r/min離心6 min，收集上清液，根據試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 按“2.2”項下方法分組及給藥，培養24 h后收集細胞，4 ℃、3 000 r/min離心6 min，根據凋亡試劑盒說明書，加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，室溫避光孵育20 min，通過CytoFLEX流式細胞儀分析。

2.5 RT-qPCR檢測細胞中miR-374a-5p表達 將Trizol試劑添加到軟骨細胞中提取總RNA，通過Nanodrop2000c光度計檢測RNA濃度，使用反轉錄試劑盒進行cDNA制備。取2 μL cDNA，10×PCR Buffer、MgSO4、dNTPs各2.5 μL、正反向引物各0.5 μL，與RNase-Free ddH2O配制25 μL RT-qPCR擴增體系進行反應。miR-374a-5p正向5′-GACG ACTGTAGCTGATGATCG-3′，反向5′-TCCATACGATCGA CTAGCTCA-3′；內參U6正向5′-GCTTCGGCAG CACATATACT-3′，反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。采用2-ΔΔCT法計算miR-374a-5p相對表達量。

2.6 Western blot檢測細胞Bcl-2、Bax蛋白表達 按“2.2”項下方法分組及給藥，培養24 h后收集細胞，加入RIPA裂解液以提取總蛋白，蛋白變性后通過SDS-PAGE蛋白電泳，轉膜，室溫封閉2 h，分別加入一抗(1∶1 000)與內參(1∶1 000)稀釋液，4 ℃孵育24 h，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，化學發光試劑顯影，采用Image J軟件分析各條帶灰度值。

3 結果

3.1 番茄紅素對IL-1β誘導軟骨細胞炎性反應的影響 與對照組比較，IL-1β組細胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.01)；與IL-1β組比較，IL-1β+番茄紅素各劑量組細胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見表1。

表1 番茄紅素對IL-1β誘導軟骨細胞炎性反應的影響

3.2 番茄紅素對IL-1β誘導軟骨細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 與對照組比較，IL-1β組細胞凋亡率升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01)，Bax蛋白表達升高(P<0.01)；與IL-1β組比較，IL-1β+番茄紅素各劑量組細胞凋亡率降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達升高(P<0.01)，Bax蛋白表達降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見圖1、表2。

表2 番茄紅素對IL-1β誘導軟骨細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

圖1 番茄紅素對IL-1β誘導軟骨細胞凋亡(A)及Bcl-2、Bax蛋白表達(B)的影響

3.3 番茄紅素對IL-1β誘導軟骨細胞中miR-374a-5p表達的影響 與對照組比較，IL-1β組細胞中miR-374a-5p表達降低(P<0.01)；與IL-1β組比較，IL-1β+番茄紅素各劑量組細胞中miR-374a-5p表達升高(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見表3。

表3 番茄紅素對IL-1β誘導軟骨細胞中miR-374a-5p表達的影響

3.4miR-374a-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞炎性反應的影響 與IL-1β+miR-NC組比較，IL-1β+miR-374a-5p組細胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平降低(P<0.01)，見表4。

表4 miR-374a-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞炎性反應的影響

3.5miR-374a-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 與IL-1β+miR-NC組比較，IL-1β+miR-374a-5p組細胞凋亡率降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達升高(P<0.01)，Bax蛋白表達降低(P<0.01)，見圖2、表5。

圖2 miR-374a-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞凋亡(A)及Bcl-2、Bax蛋白表達(B)的影響

3.6 干擾miR-374a-5p表達逆轉番茄紅素對IL-1β誘導軟骨細胞炎性損傷的作用 與IL-1β+番茄紅素+anti-miR-NC組比較，IL-1β+番茄紅素+anti-miR-374a-5p組細胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.01)，細胞凋亡率升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01)，Bax蛋白表達升高(P<0.01)，見圖3、表6。

表6 干擾miR-374a-5p表達逆轉番茄紅素對IL-1β誘導軟骨細胞炎性損傷的作用

圖3 干擾miR-374a-5p表達逆轉番茄紅素對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡(A)及Bcl-2、Bax蛋白表達(B)的作用

表5 miR-374a-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

4 討論

軟骨細胞炎癥反應、氧化應激及細胞凋亡等均能促進骨關節炎的發生，天然藥物具有抗炎、抗氧化等作用，并可以抑制軟骨細胞凋亡[10-11]，但關于天然藥物在骨關節炎治療中的作用機制尚未完全闡明。

番茄紅素可以通過抑制心肌細胞凋亡從而減輕心肌細胞氧化損傷[12]，還可預防神經系統性疾病的發生[13]。研究發現，番茄紅素可以抑制糖尿病大鼠的氧化應激反應并改善視網膜線粒體損傷[14]。本研究中，IL-1β使軟骨細胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高，與文獻[15]報道結果相似，提示模型建立成功。使用2.5、5、10 μmol/L番茄紅素處理后，軟骨細胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平隨著番茄紅素劑量的增加而降低，表明番茄紅素可降低IL-1β引起的軟骨細胞炎癥反應，且呈劑量依賴性。軟骨細胞凋亡在骨關節炎的發病機制中起關鍵作用，通過增加Bcl-2水平及降低Bax水平有助于減輕軟骨細胞的凋亡[16]。本研究中，軟骨細胞在IL-1β刺激后發生凋亡，而番茄紅素降低凋亡率，并上調Bcl-2表達，下調Bax表達，表明番茄紅素對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡具有抑制作用，且呈劑量依賴性。

本研究結果發現，番茄紅素可上調IL-1β處理的軟骨細胞miR-374a-5p表達，且呈劑量依賴性，提示番茄紅素保護軟骨細胞損傷的作用可能與上調miR-374a-5p有關。miR-374a-5p表達上調對神經系統[17]、暴露于低氧的神經細胞損傷[18]起保護作用。本研究中，miR-374a-5p過表達可降低IL-6、TNF-α、IFN-γ水平，還可上調Bcl-2、下調Bax來抑制細胞凋亡，提示miR-374a-5p過表達可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥反應及細胞凋亡。為探究番茄紅素是否通過調控miR-374a-5p的表達而發揮作用，本研究將anti-miR-374a-5p轉染至軟骨細胞，分別使用IL-1β與番茄紅素共同處理，結果顯示IL-6、TNF-α、IFN-γ水平、凋亡率均升高，提示番茄紅素保護軟骨細胞IL-1β損傷的作用可能是通過上調miR-374a-5p來實現的。

綜上所述，番茄紅素可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎性損傷及細胞凋亡，其機制可能是通過上調miR-374a-5p的表達，可為骨關節炎的治療提供潛在靶點。