枯草芽孢桿菌KXZ-33與化學藥劑協同防控棉花枯萎病的效果評價

趙瑩瑩，張軍高，李 進，梁 晶，高翔宇，顧愛星，雷 斌

(1.新疆農業大學農學院,烏魯木齊 830052；2. 新疆農業科學院核技術生物技術研究所/新疆作物化控調控工程技術研究中心，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌萎蔫?；?Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)通過侵染棉花纖維束而造成的系統性病害，是世界性土傳性病害[1]，在棉花的全生育期均可發生[2-3]。針對棉花枯萎病主要的防治有化學農藥、種植抗病品種、與其他作物輪作等措施?；瘜W農藥的過度使用會造成一系列的環境問題，[4-5]，生物防治是采用真菌、細菌、放線菌，通過調節土壤環境、分泌次生代謝物、競爭作用等拮抗機制達到病害防治的目的[6]。芽孢桿菌屬對多種植物病害的發生都有拮抗作用，在自然界中廣泛存在，且在不利環境下可以形成穩定的芽孢[7]?！厩叭搜芯窟M展】芽孢桿菌可以在低劑量的化學殺菌劑正常生長，將芽孢桿菌與化學殺菌劑相結合，在防治棉花枯萎病等真菌性病害時可以彌補兩者的缺陷，在起到防治效果的同時又可以減少化學農藥的使用[8]。此策略在植物保護領域廣泛探討，并取得成效[9]。將枯草芽孢桿菌屬、多粘芽孢桿菌屬、貝萊斯芽孢桿菌[10]、蠟狀芽孢桿菌屬、解淀粉芽孢桿菌屬[11]、地衣芽孢桿菌[12]、甲基營養性芽孢桿菌[13]等與殺菌劑成功復配。賀惠文等[12]利用地衣芽孢桿菌W10與多菌靈按照100∶1的復配比例下對桃樹褐斑病的防治效果有大幅度提升?！颈狙芯壳腥朦c】因生防菌受環境、氣候、定植能力影響較大，實際大田防治效果并不理想。需開展從棉花枯萎病發病嚴重病田中，分離出有篩選出拮抗效果的生防細菌?！緮M解決的關鍵問題】以棉花枯萎病主要致病菌尖孢鐮刀菌為研究對象，采用室內平板對峙試驗篩選拮抗細菌，含毒介質法對化學殺菌劑進行毒力測定，篩選出與生防細菌與化學藥劑協同防治棉花枯萎病有穩定防效的組合方式，彌補生防細菌在實際運用中的防效，減少化學農藥的使用，減緩植物病害抗病性的增加，為農藥減施和綠色生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試棉花品種為979，新疆金豐源種業股份有限公司提供；供試病原菌為棉花枯萎病萎蔫?；椭械戎虏×Φ?號生理小種st89(F.oxysporum)，由新疆農業大學植物病理實驗室提供。供試枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KXZ-33、KXZ-4由新疆農業大學植物病理實驗室中保存，莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)Hwt-34、Twt-34，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)UB7-1和A57由新疆農業學院核技術生物技術研究所保存。供試殺菌劑：50%甲基硫菌靈可濕性粉劑(四川潤爾科技有限公司)、80%代森錳鋅可濕性粉劑(山東鄒平農藥有限公司)、80%乙蒜素乳油(壽光禾大壯生物科技有限公司)、50%福美雙可濕性粉劑(山東百農思達生物科技有限公司)、30%噁霉靈可濕性乳油(四川潤爾科技有限公司)、40%多菌靈懸浮劑(深圳諾普信農化股份有限公司)、43%氟菌肟菌酯乳油(德國拜耳股份公司生產)。均為市售。

1.2 方 法

1.2.1 拮抗細菌的篩選與鑒定

將實驗室保存的拮抗細菌從4℃冰箱取出，在NA培養基上活化24 h備用。將尖孢鐮刀菌st89從-20℃甘油取出，在PDA培養基上活化7 d備用。將活化后的棉花枯萎病病原菌利用打孔器(Φ：6 mm)接到PDA培養基的中心，并將6種拮抗細菌利用牙簽(已滅菌)涂到距離病原菌左、右1 cm處，并涂等量蒸餾水做CK，每個處理重復3次，待CK長到滿皿時采用平板對峙法[14]，測量每株拮抗細菌的抑菌寬度，計算抑菌率[15]。

菌絲生長抑制速率(%)=

1.2.2 室內化學殺菌劑的毒力測定

選取7種化學藥劑利用菌絲抑制生長速率法[16]測定毒力大小。將2 g化學藥劑溶解到100 mL無菌水中，配制成藥劑含量為20 g/L的母液備用。按照不同比例稀釋后，加入經滅菌后、冷卻到60℃的PDA培養基中，將50%甲基硫菌靈可濕性粉劑、40%多菌靈懸浮劑、43%氟菌肟菌酯乳油、80%代森錳鋅可濕性粉劑、80%乙蒜素乳油、30%噁霉靈可濕性乳油、50%福美雙可濕性粉劑制備成6.15、12.5、25、50、100 mg/L(制劑濃度)的含藥PDA培養基，加入等量的蒸餾水做空白對照。利用打孔器(Φ：6 mm)將長勢良好且生長狀態一致的病原菌制成菌餅后，接到不同含藥濃度的PDA培養基中，每組試驗重復3次。待7 d后觀察菌絲生長情況，測定菌絲生長寬度，并計算菌絲生長抑制速率，同上。表1

1.2.3 KXZ-33與化學藥劑的相容性檢測1.2.3.1 種子液制備

將活化好的KXZ-33利用接種環在無菌條件下接入裝有NA液體培養基的三角瓶中，30℃、24 h搖床活化,再接入NA液體培養基中30℃、24 h制成種子液備用[17]。

1.2.3.2 相容性測定

將生防細菌KXZ-33種子液接到含有效成分含量為20、50 mg/L甲基硫菌靈、多菌靈、福美雙的改良NYBD液體培養基中，30℃、180 r/min、恒溫搖床上培養24 h后利用紫外分光光度計測量OD600。將培養液梯度稀釋10-6、10-7、10-8進行平板計數法統計活菌數，確定與KXZ-33相容性最好的化學藥劑。

1.2.4 KXZ-33與化學藥劑協同防治棉花枯萎病盆栽試驗

將籽粒飽滿均勻的棉種用75%乙醇消毒30 s后晾干，將棉種放入活菌數為1×107cfu/mL的KXZ-33發酵液中浸種30 min，蒸餾水浸種30 min作為CK。將棉種播種到裝有營養土中，花盆長×寬×高為120 mm×120 mm×100 mm，每盆12粒。用待棉花長至2片真葉時進行利用傷根接菌法進行接菌，接菌3 d后噴施化學殺菌劑。試驗共設置6個處理，每組4個重復，其中A：KXZ-33浸種；B：噴施30 mg/L的甲基硫菌靈10 mL；C: KXZ-33浸種+噴施15 mg/L甲基硫菌靈10 mL；D：噴施20 mg/L多菌靈10 mL；E：KXZ-33浸種+噴施10 mg/L的多菌靈10 mL；F：CK。分別在藥劑處理后7、14 、21 、28 d分別調查棉花的病情指數，并計算防病效果。苗期棉花病情分級標準參照石磊巖5級分類標準進行調查[18]。

防治效果(%)=

1.3 數據處理

用Microsoft Excel 2010進行數據計算，SPSS 25.0軟件進行方差分析(P<0.05)，Duncan法進行多重比較檢驗,GraphPad Prism 7.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 棉花根基細菌對尖孢鐮刀菌的抑制率

研究表明，3株對棉花枯萎病病原菌的抑制率達到70.00%以上，其中KXZ-33菌株對尖刀鐮孢菌的抑菌率最高為79.53%,Hwt34的抑菌率最低為56.69%。UB17-1對棉花枯萎病的抑菌率可達到75.51%，Twt34的抑菌率為71.65%。KXZ-33、UB17-1和Twt343種生防細菌對棉花枯萎病的防治均有較大的生防潛力。表1

表 1 棉花根基細菌對尖孢鐮刀菌的抑制率Table 1 The inhibition rate of bacteria from cotton roots against F.oxysporum

2.2 室內化學殺菌劑的毒力測定

研究表明，50%甲基硫菌靈可濕性粉劑、40%多菌靈懸浮劑、43%氟菌肟菌酯乳油、80%代森錳鋅可濕性粉劑、80%乙蒜素乳油、80%噁霉靈乳油、50%福美雙可濕性粉劑的EC50分別為15.840 1、18.018 0、188.827 7、1 987.788 6、125.748 0、89.221 3、12.794 0 mg/L。其中50%福美雙可濕性粉劑對病原菌的毒力最高，50%甲基硫菌靈可濕性粉劑、40%多菌靈懸浮劑次之，且三者EC50值都小于20 mg/L。40%多菌靈懸浮劑的靈敏度最高。毒力較差的分為是80%乙蒜素乳油、80%代森錳鋅可濕性粉劑，其中80%代森錳鋅可濕性粉劑最差為1 987.788 6 mg/L。表2

表 2 化學殺菌劑對尖刀鐮孢菌的室內毒力測定Table 2 Laboratory toxicity test of chemical pesticides to F.oxysporum

2.3 KXZ-33與化學藥劑的相容性

研究表明，在含20 mg/L KXZ-33在含有不同濃度的化學殺菌劑NYBD液體培養基中培養24 h后，CK活菌數為2.41×107cfu/mL，含有20 mg/L的甲基硫菌靈的改良NYBD液體培養基中的活菌數為2.18×107cfu/mL的相容性最佳，與生防細菌的相容性達到90.46%。含有50 mg/L的甲基硫菌靈改良NYBD液體培養基中的活菌數為1.76×107cfu/mL，KXZ-33的相容性為73.03%，與20 mg/L的甲基硫菌靈相比下降了17.43%。20 mg/L的多菌靈活菌數為1.45×107cfu/mL,與KXZ-33的相容性為60.17%。KXZ-33與福美雙的相容性最低，50 mg/L福美雙下無法正常生長。圖1

圖1 KXZ-33與化學藥劑的相容性Fig.1 Compatibility analysis of KXZ-33 with chemical agents

2.4 化學殺菌劑與KXZ-33協同防控棉花枯萎病效果

研究表明，KXZ-33在與化學殺菌劑協同使用時，50%甲基硫菌靈可濕性粉劑與40%多菌靈懸浮劑在防效上表現出較大的差異。施藥7 d時，E:組KXZ-33浸種+10 mg/L多菌靈的防治效果最好為90.5%，A組：KXZ-33浸種的防效為72.4%，C組：KXZ-33浸種+10 mg/L甲基硫菌靈的防治效果為87.7%。施藥后14 d防治效果均有所下降，E組：KXZ-33浸種+10 mg/L多菌靈下降最為明顯，C組：KXZ-33浸種+10 mg/L甲基硫菌靈防效最高為57.7%。E防效持續下降為35.2%，且與D組防效相當。施藥后21 d，C組：KXZ-33浸種+10 mg/L甲基硫菌靈的防效最高為56.3%，優于單獨使用化學藥劑、KXZ-33浸種的試驗組。施藥28 d時C組的防效最高為43.7%，相較于其他試驗組穩定性最強，E組防治效果為27.0%。KXZ-33與化學殺菌劑進行協同防治的過程中雖然整體防效表現為下降趨勢，但10 mg/L甲基硫菌靈與生防菌KXZ-33的協同防治效果優于10 mg/L多菌靈與生防菌KXZ-33的防治效果。在28 d時棉花枯萎病的防病效果KXZ-33浸種+10 mg/L甲基硫菌靈>20 mg/L甲基硫菌靈>KXZ-33浸種+10 mg/L多菌靈>KXZ-33浸種>20 mg/L多菌靈。表4

表4 不同化學殺菌劑與KXZ-33協同防控棉花枯萎病的防病效果Table 4 Synergistic control effect of different chemical fungicides and KXZ-33 on Fusarium wilt of cotton

3 討 論

劉郵洲等[19]通過利用1×1010cfu/mL可濕性枯草芽孢桿菌與17%咪鮮胺錳鹽進行協同防治番茄枯萎病在田間70 d的防效可以達到79.5%，實現對番茄枯萎病的有效防治。棉花初期使用拮抗菌KXZ-33浸種后的實驗組的棉花枯萎病的防效較未使用KXZ-33的實驗組防病效果高，但隨著時間的延長KXZ-33在土壤的復雜環境中的生防細菌的防效從72.4%逐漸降低到20.2%。

崔凱等[20]探究甲基硫菌靈與其主要代謝產物多菌靈對棉花枯萎病的根基細菌多樣性與相對豐富度表明，高劑量的化學農藥會降低根際土壤細菌多樣性與相對豐富度的降低。KXZ-33與甲基硫菌靈具有很好的相融性，并通過種子處理與噴施相結合方式在室內進行了評價，而種子包衣是一項先進的輕簡化種子處理技術，具有高效、低毒、環保等優點，也是農藥減施、綠色生產的有效措施。

4 結 論

7種化學殺菌劑對病原菌的生長有不同程度影響顯示。50%福美雙可濕性粉劑對尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)的毒力最強，50%甲基硫菌靈可濕性粉劑、40%多菌靈懸浮劑次之，80%代森錳鋅可濕性粉劑的毒力最差。20 mg/L甲基硫菌靈的OD600與CK差距最小，且較高濃度50 mg/L的甲基硫菌靈也對生防細菌有較高的相容性，20 mg/L多菌靈次之。無論是低濃度20 mg/L福美雙，還是高濃度50 mg/L的福美雙與生防細菌KXZ-33的相容性都較差。

甲基硫菌靈與KXZ-33的聯合使用中可以有效的提高棉花枯萎病的防治效果，在生防細菌隨時間推移的防治效果下降的情況下，合理的使用化學殺菌劑可以達到提高的防效作用。