新疆橡膠草銹病病原菌的分離與鑒定

韓 盛，高 強，邢 濤，徐 麟，任海龍,4，嚴青青，玉山江·麥麥提，張 龑，李文慧

(1.新疆農業科學院植物保護研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農業科學院農作物品種資源研究所，烏魯木齊 830091；3.山東玲瓏輪胎股份有限公司，山東招遠 2654003；4.廣州市農業科學研究院生物與遺傳育種重點實驗室，廣州 510308；5.新疆農業科學院輪臺果樹資源圃，新疆輪臺 830000)

0 引 言

【研究意義】橡膠草(Taraxacumkok-saghyzRodin, TKS)，又名俄羅斯蒲公英或青橡膠蒲公英[1]，為菊科蒲公英屬多年生草本植物，因其根部含有豐富的高品質橡膠，且分子結構與三葉橡膠相同，使之成為極具有發展前途的三葉橡膠樹橡膠替代作物[2-5]。另一種產膠蒲公英屬植物是短角蒲公英 (Taraxacumbrevicorniculatum，TB) ，形態及生境與 TKS極為相近[6]。橡膠草的栽培、優選、根處理及橡膠提取等進行了較為系統研究[7]。新疆作為蒲公英橡膠草的原生地之一，具有豐富的野生橡膠草資源和規模化發展橡膠草產業的生態條件。研究引起橡膠草銹病的病原菌種類，對于采取針對性措施防治該病具有重要意義。【前人研究進展】國內關于橡膠草銹病的研究較少，但有對橡膠草近緣種蒲公英銹病的報道。甘南瑪曲地區不同季節和不同海拔的蒲公英(TaraxacummongolicumHand)銹病發生規律，并采用光學顯微鏡和掃描電鏡等技術手段對蒲公英銹菌冬孢子的形態進行分析，認為該地區蒲公英銹病的病原菌為山柳菊柄銹菌(PuccniciahieraciiMartius)[8, 9]。【本研究切入點】李春龍[10]提出了蒲公英銹病防治方法，但未明確介紹蒲公英銹病的病原菌種類。2018～2020年在伊犁哈薩克自治州農業科學研究所的橡膠草試驗地發生了嚴重的銹病危害，但是關于引起新疆地區橡膠草銹病的病原尚不清楚。目前，國內關于山柳菊柄銹菌的研究報道較少。需研究引起新疆伊犁地區橡膠草銹病的病原菌種類。【擬解決的關鍵問題】采集并分離新疆伊犁地區橡膠草銹病病原菌，根據柯赫氏法則對該病原菌的致病性進行的驗證，并對所分離獲得的病原菌進行了形態學及分子生物學鑒定。為開展該病的病原菌致病性、品種抗病性鑒定、病害綜合防控技術等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試植物：感病橡膠草于2020年6月采集自伊犁州農科所橡膠草試驗地； 2017-3號、5號2個橡膠草品種于新疆農業科學院植物保護研究所室內種植備用。

引物：真菌通用引物NL1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')/NL4(5'-GGTCCGT-GTTTCAAGACGG-3')[11]；銹菌通用引物ITS5-u(5'-CAAGGTTTCTGTAGGTG-3')/(ITS4rust：5'-CAGATTACAAATTTGGGCT-3')[12]。引物委托上海派森諾生物科技有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 橡膠草銹病田間調查

2020年5月至8月，調查伊犁州農科所橡膠草試驗地對橡膠草銹病的發生情況，每隔7 d觀察1次，直至橡膠草全部葉片脫落為止，觀察發生銹病的橡膠草葉片病斑的大小、形狀、顏色、危害程度等性狀。

1.2.2 橡膠草銹菌形態特征

選取感病橡膠草的葉片，用解剖針挑取孢子堆上的銹菌，用光學顯微鏡觀察孢子的形態并測量其大小。

1.2.3 橡膠草銹菌的致病性鑒定

挑取田間發病葉片上的單個孢子堆于培養皿上，用挑針破壞孢子堆以釋放夏孢子，加100 ～ 150 μL去離子水輕輕混勻以使孢子散于水中，配置成孢子懸浮液。用手指蘸取孢子懸浮液，順著健康葉片自下而上輕輕涂抺，完成接種。用透明塑料隔離罩罩住接種的橡膠草幼苗，移至20℃恒溫光照培養箱，黑暗保濕24 h，保濕結束后設置恒溫光照培養箱光照強度為8 000～10 000 Lux，光周期為16 h光照，8 h黑暗，接種后7 ～ 15 d 觀察發病情況，對發病的橡膠草葉片病原菌重再次進行顯微鏡觀察鑒定。由田間病樣單菌落接種健康橡膠草后獲得的菌株命名為PXJ-1,通過將菌株PXJ-1進一步接種健康橡膠草擴繁作為后續試驗的菌源。

1.2.4 橡膠草銹菌的分子鑒定

將室內接種擴繁保存于橡膠草上的銹菌夏孢子從葉片上刮下來，迅速用液氮研磨。采用真菌DNA提取試劑盒提取銹菌全基因組DNA，以其全基因組DNA為模板進行PCR擴增。應用1.1所示的真菌通用引物NL1/NL4和銹菌通用引物ITS5-u/ITS4rust分別對病原菌的28S rDNA和ITS序列區域進行PCR擴增，PCR擴增產物的測序由上海生工生物工程(上海)股份有限公司完成。將獲得的核酸序列在NCBI進行BLAST比對分析，利用MEGA 6.0軟件對測序結果進行同源性比對，采用鄰接法構建系統發育樹進行系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 橡膠草銹病發生情況及田間癥狀

研究表明，新疆伊犁地區橡膠草銹病于每年5月橡膠草返青后開始發病，發病葉片散生點狀棕色夏孢子堆，6月達發病高峰期，7月隨氣溫逐漸升高，橡膠草進入夏眠期，該病發生嚴重度逐漸降低。該病于第2年生的橡膠草發病較重，當年種植的橡膠草發病較輕。橡膠草銹菌夏孢子堆著生于葉的兩面，直徑0.5～1.0 mm，夏孢子堆初期生于葉表皮下，夏孢子堆逐漸增大后可突破葉表皮而外露，此時夏孢子堆呈粉狀，黃褐色。圖1

注：A.田間橡膠草銹病發病癥狀；B.田間病樣分離銹菌病原接種5號橡膠草品種發病癥狀；C: 田間病樣分離銹菌病原接種2017-3號橡膠草品種發病癥狀；

2.2 橡膠草銹菌的形態特征及致病性

研究表明，橡膠草銹菌夏孢子近球形、橢圓形或卵圓形，大小為(24～32 × 21～26) μm，淡黃色至栗褐色，有刺，單胞，壁厚為1～2.5 μm。橡膠草銹病接種10～12 d即可在葉片表面形成夏孢子堆，夏孢子堆淺棕色，突破表皮后成棕色、粉狀。由田間發病橡膠草葉片采集獲得的銹菌單菌落接種健康橡膠草后，其接種葉片均表現出與田間相似的癥狀，而對照株葉片則無癥狀。圖2

圖2 橡膠草銹菌夏孢子Fig.2 Summer spores of rubber grass rust

2.3 橡膠草銹菌的分子鑒定

研究表明，菌株PXJ-1(序列登錄號分別為MN841787.1)與山柳菊柄銹菌(PuccniciahieraciiMartius)(序列登錄號為KX985752.1)的同源性最高，達到了99.52%。進一步選擇銹菌通用引物ITS5-u和ITS4rust進行PCR擴增，得到大小為476 bp的片段，菌株PXJ-1(序列登錄號為MT579659.1)與山柳菊柄銹菌P.hieraciistrainDAOM240969(序列登錄號為HQ317515.1)的同源性達到了99.06%，同樣為最高。菌株PXJ-1序列與山柳菊柄銹菌的遺傳距離最近，確定引起橡膠草銹病的病原菌為山柳菊柄銹菌(PuccniciahieraciiMartius)。圖3

圖3 基于ITS序列構建橡膠草銹病菌株XJ-1及相似病菌的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the pathogen strain XJ-1 of rust disease on rubber grass and related strains based on ITS sequence

3 討 論

張蓉等[8]鑒定甘肅甘南高寒草地的蒲公英(TaraxacummongolicumHand)銹病致病菌為山柳菊柄銹菌。劉鐵志等[13]也報道了貓兒菊(Hypochaerisciliata)上的山柳菊柄銹菌貓兒菊變種(Pucciniahieraciivar.hypochaeridis)為中國新記錄，并對其形態特征進行了詳細描述。橡膠草與其近緣種短角蒲公英(TaraxacumbrevicorniculatumTB)和普通蒲公英(TaraxacumofficinaleTO)廣泛共域存在[14]。短角蒲公英根部也產生天然橡膠[15]，其在新疆也有分布[16]。自然界中銹菌存在同種銹菌可侵染多種寄主的現象[17, 18]，橡膠草近緣種蒲公英發生的銹菌是否也能夠侵染橡膠草有待于進一步研究證實。

新疆伊犁地區橡膠草銹病于每年5月橡膠草返青后開始發病， 6月達發病高峰期，7月隨氣溫逐漸升高，橡膠草進入夏眠期，該病發生嚴重度逐漸降低，這表明橡膠草銹病發生危害程度與氣溫、寄主生長發育階段可能有一定相關性。張蓉等[8]調查發現，甘南瑪曲高寒草地蒲公英銹病發病率和病情指數隨著海拔的升高而呈降低趨勢，較高的溫度、光照條件和濕度有利于蒲公英銹病的發生，該調查結果與伊犁地區橡膠草銹病高溫不利于發病的趨勢有所差異。溫度、寄主生長發育狀況兩者以哪種因素對橡膠草銹病發病程度影響更大有待于進一步研究。山柳菊柄銹菌對橡膠草的侵染機制及病害防治措施等仍需進一步研究。

4 結 論

新疆伊犁地區橡膠草銹病于每年5月橡膠草返青后開始發病，6月達發病高峰，7月隨氣溫逐漸升高橡膠草進入夏眠期，該病發生嚴重度逐漸降低，暗示該病發生危害嚴重與氣溫、寄主生長發育階段可能有一定相關性。新疆伊犁地區引起橡膠草銹病的病原菌為山柳菊柄銹菌。