貝萊斯芽孢桿菌JTB8-2對加工番茄促生作用及其安全性評價

何 偉，羅文芳，周軍輝，許建軍，孫曉軍

(新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】土壤中存在大量微生物，包括細菌、真菌、藻類和線蟲等，其中大部分微生物是有益微生物。土壤有益微生物能夠改善土壤結構，培肥地力，分解有機質、礦物質，調節植物生長和抑制病原微生物。貝萊斯芽孢桿菌是在促進植物生長、防病和系統誘導抗性等方面菌具有應用潛力。前期從新疆加工番茄田間土壤中分離獲得一株貝萊斯芽孢桿菌JTB8-2，研究土壤中分離獲得的貝萊斯芽孢桿菌對番茄的促生作用及其安全性，對該菌株在新疆加工番茄田間應用有重要意義。【前人研究進展】貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是芽孢桿菌屬的一個新種，Ruiz-Garcá于2005年自西班牙南部城市馬拉加貝萊斯河流口分離出2株芽孢桿菌，經16S rRNA基因序列及生理生化反應鑒定為貝萊斯芽孢桿菌[1]。從土壤、海洋、池塘和植物組織等多種生境中分離獲得貝萊斯芽孢桿菌，其在食品發酵、農業生產和生態環境修復上有應用研究[2-5]。地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(B.cerels)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)等[6-9]。貝萊斯芽孢桿菌BAC03對甜菜、胡蘿卜、黃瓜、辣椒、馬鈴薯、蘿卜、南瓜、番茄、蘿卜等9種植物具有潛在的促生長作用[10]。貝萊斯芽孢桿菌BS89有能力促進植物生長，并產生生長素和維生素的混合物[11]。貝萊斯芽孢桿菌B006菌劑對茄子氮、磷、鉀的吸收具有促進作用，可以促進植株生長，即使在少水灌溉，茄子產量不降低[12]。使用貝萊斯芽孢桿菌氯仿粗提物10～500倍稀釋液對玉米、豌豆和胡豆分別進行浸種和灌根可以促進種子發芽和幼苗生長[13]。【本研究切入點】雖然貝萊斯芽孢桿菌發現較晚，但由于與其生長速度快、代謝產物抗菌活性強、環境友好等特點，其在農業生產中具有很大的應用潛力。目前，國內外對貝萊斯芽孢桿菌促生作用研究報道很多。而土著菌株更適宜新疆土壤環境，易在新疆土壤中定植與繁殖。需研究新疆本地加工番茄田土壤中獲得的貝萊斯芽孢桿菌JTB8-2對加工番茄促生作用和安全性。【擬解決的關鍵問題】貝萊斯芽孢桿菌JTB8-2分離自新疆加工番茄田間土壤中，研究其對加工番茄促生能力及對其他作物種子萌發及芽生長的作用，為該菌株開發與應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

貝萊斯芽孢桿菌JTB8-2分離自新疆吉木薩爾縣工業番茄田莖基部罹病瓜列當根際土壤。菌株已鑒定[14]，并保存于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)。保藏編號GDMCC No.60755。

微生物菌劑“寧盾”(蠟樣芽孢桿菌，有效活菌數≥0.2×108個/mL，江蘇無錫本元生物有限公司)。

加工番茄品種為屯河9號和亨氏1015。

作物種子為白菜、番茄、豇豆、茄子、絲瓜、四季豆、西葫蘆、油麥菜、菠菜、芹菜、西瓜、黃瓜、甜瓜、大豆、綠豆、棉花、玉米、花生、向日葵和小麥。

1.2 方 法

1.2.1 菌株發酵液制備

將保存的菌株轉接于NA(牛肉膏3 g，蛋白胨7 g，NaCl 5 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL)平板中，28℃培養48 h，使用滅菌槍頭將單菌落轉接于100 mL NB(牛肉膏3 g，蛋白胨7 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL)培養基中，28℃，135 r/min振蕩培養48 h后即為種子發酵液。將種子發酵液轉接于裝有3 L NB培養基中，28℃，135 r/min振蕩培養72 h即為菌株發酵液。采用平板菌落計數法菌液濃度，采用無菌水將種子菌液進行系列濃度梯度稀釋，稀釋濃度分別為10-5、10-6、10-7和10-8。采用移液槍分別取各濃度的稀釋液100 μL，采用玻璃涂布棒均勻涂布于NA平板上，每個稀釋梯度3次重復，置于培養箱里培養48 h后，計數每個平板中菌落數量，計算菌液濃度。

菌液濃度(CFU/mL)=平板菌落數×稀釋倍數/0.1 mL。

1.2.2 苗期處理

番茄采用穴盤基質育苗，穴盤為128穴。菌株發酵液濃度為5×108CFU/mL。設置7個處理，分別為菌株JTB8-2發酵液25倍液處理、50倍液處理和100倍液處理，菌劑“寧盾”處理25倍液處理、50倍液處理和100倍液處理和清水對照處理，每處理15盤。在90%以上番茄苗出土以后開始第1次噴淋穴盤，噴淋標準為穴盤底部滲出水為止。間隔7 d噴淋1次，連續噴淋3次。

分別于第3次噴淋后7和14 d調查番茄植株生長情況，每處理隨機選取3個穴盤，每穴盤分別調查第3、8和13排8株苗。第1次調查不同處理番茄植株株高和莖粗；第2次調查番茄植株株高、莖粗、莖部鮮重和根部鮮重。

1.2.3 盆栽處理

2020年盆栽試驗設置2個處理，分別為菌株發酵液澆灌處理和空白對照(清水澆灌處理)。每處理18盆。番茄苗選擇同一品種(屯河9號)，基質穴盤育苗。在番茄苗4～5葉期時移栽，每盆1株苗。塑料盆規格為直徑25 cm、高18 cm，底部帶孔。每盆放置1株番茄苗后覆土。盆栽土為基質∶蛭石∶土壤(1∶1∶2)。菌株發酵液濃度為5×108CFU/mL。菌株發酵液澆灌處理為每盆澆灌400 mL發酵液，空白對照為每盆澆灌400 mL清水，間隔10 d澆灌1次，連續澆灌3次。移栽65 d后撥出番茄植株，自來水沖洗根部后稱取列當植株鮮重、番茄植株鮮重。

2021年盆栽試驗設置7個處理，分別為菌株JTB8-2發酵液25倍液處理、50倍液處理和100倍液處理，菌劑“寧盾”處理25倍液處理、50倍液處理和100倍液處理和清水對照處理。番茄品種為亨氏1015。移栽番茄苗選用穴盤育苗對應處理，每處理9盆。盆栽土壤選擇安寧渠農業田間土壤。塑料盆規格及番茄苗移栽方法同2020年盆栽試驗。移栽當天澆灌菌液1 L/盆，間隔15 d澆灌1次，連續澆灌3次，對照澆灌清水。

1.2.4 菌株發酵液對作物種子安全性評價

設置5個處理，分別為發酵原液、25倍液、50倍液、100倍液和清水對照(CK)。將種子在75%酒精中表面消毒30 s，無菌水漂洗3次后晾干備用。將一片滅菌濾紙放置于培養皿中后分別將滅菌種子放置在濾紙上，種子量為20粒/皿。分別在不同處理中加入無菌濾液和滅菌水，大粒種子6 mL/皿,小粒種子4 mL/皿。黑暗條件培養，若水分及菌液被種子吸收殆盡時，及時補充。每處理3次重復。待種子發芽后，每皿拍照，測量芽長，記錄發芽數。

2 結果與分析

2.1 穴盤育苗期貝萊斯芽孢桿菌JTB8-2對加工番茄促生作用

研究表明，番茄育苗期使用JTB8-2菌株發酵菌液和微生物菌劑“寧盾”對番茄植株具有促生作用，JTB8-2菌劑和微生物菌劑“寧盾”處理的番茄根系較清水對照發達，植株較清水對照粗壯。JTB8-2菌株發酵菌液和微生物菌劑“寧盾”25、50和100倍稀釋液番茄植株株高、莖粗、莖鮮重和根鮮重均顯著高于清水處理。菌株JTB8-2發酵液各稀釋倍數的番茄株高、莖粗、莖鮮重和根鮮重高于微生物菌劑“寧盾”同稀釋濃度，其中菌株JTB8-2發酵液50倍液對番茄植株生長促生作用最好，其株高、莖粗及根部鮮重均顯著高于其他處理；其次是菌株JTB8-2發酵液25倍液，其番茄植株株高、莖粗和根鮮重顯著高于100倍液。圖1,圖2,表1

圖1 不同處理番茄根部生長比較Fig.1 Tomato root growth under different treatments

圖2 不同處理番茄植株生長情況Fig.2 Tomato plant growth under different treatments

表1 不同處理番茄植株生長比較Table 1 Comparison of tomato plant growth under different treatments

2.2 盆栽試驗中貝萊斯芽孢桿菌對加工番茄促生效果

研究表明，菌株JTB8-2發酵液處理番茄植株鮮重顯著高于空白對照，菌株JTB8-2對番茄植株具有促生作用。圖3

圖3 菌株發酵液對加工番茄植株促生效果Fig.3 Effect of strain fermentation liquid on tomato plant growth promotion

菌株JTB8-2發酵液和微生物菌劑“寧盾”25倍液、50倍液和100倍液處理的番茄植株莖鮮重顯著高于NB培養基25倍液、50倍液、100倍液和清水對照處理，菌株JTB8-2發酵液25倍液、50倍液和100倍液和微生物菌劑“寧盾”25倍液處理番茄根鮮重顯著高于NB培養基25倍液、50倍液、100倍液和清水對照處理，但微生物菌劑“寧盾”50倍液和100倍液處理的番茄根部鮮重與NB培養基25倍液、50倍液、100倍液和清水對照處理無顯著差異。菌株JTB8-2發酵液和微生物菌劑“寧盾”均可促進番茄植株生長，但菌株JTB8-2發酵液對番茄促生效果好于微生物菌劑“寧盾”。表2

表2 不同處理莖鮮重和根鮮重對比Table 2 Results of pot experiment with different treatments

2.3 菌株JTB8-2發酵液對不同作物種子安全性評價

研究表明，菌株JTB8-2發酵液原液處理的白菜、豇豆、四季豆、菠菜、油麥菜、絲瓜、黃瓜、西葫蘆、番茄、芹菜、茄子、綠豆、花生、玉米、向日葵、西瓜、大豆、甜瓜和棉花等作物種子發芽率均顯著低于25、50和100倍菌株發酵液處理和清水對照，菌株JTB8-2發酵液原液對上述作物種子萌發具有抑制作用。菌株發酵液25倍液處理的白菜、豇豆、菠菜、油麥菜、絲瓜、花生、玉米、向日葵、黃瓜、西葫蘆、大豆、甜瓜、棉花和小麥種子萌發率與清水對照無顯著差異，菌株發酵液25倍發酵液處理對上述作物種子萌發無影響。清水處理的四季豆種子萌發率顯著高于菌劑發酵液25、50和100倍、1液，菌劑發酵液25、50和100倍液均對四季豆種子萌發具有抑制作用。菌劑發酵液原液處理的白菜、豇豆、四季豆、菠菜、油麥菜、絲瓜、綠豆、玉米、黃瓜、向日葵、大豆和小麥的種子芽長均顯著低于菌株發酵液25、50和100倍、1液和清水對照，菌株發酵液25、50和100倍、1液上述種子芽長與清水對照無顯著差異或顯著高于清水對照，菌株發酵液原液對上述作物芽生長具有抑制作用，25、50和100倍、1液對上述作物種子芽生長無影響或促進種子芽生長。菌株發酵液50和100倍液處理的白菜種子芽長顯著高于清水對照，菌株發酵液50和100倍液能夠促進白菜芽生長。表3

表3 不同濃度菌株發酵液處理下作物種子萌發率和芽長變化Table 3 Seed germination rate and bud length of crops treated with fermentation broth of different concentrations of strains

續表3 不同濃度菌株發酵液處理下作物種子萌發率和芽長變化Table 3 Seed germination rate and bud length of crops treated with fermentation broth of different concentrations of strains

續表3 不同濃度菌株發酵液處理下作物種子萌發率和芽長變化Table 3 Seed germination rate and bud length of crops treated with fermentation broth of different concentrations of strains

3 討 論

土壤中存在著各種各樣的微生物，如細菌、真菌、古菌、藻類和線蟲，既可以是有益的，也可以是致病的[15]。大部分土壤微生物是有益的，且微生物具有不同的作用，如對農藥降解的作用，從土壤中分離出的芽孢桿菌DG-02能有效降解7種擬除蟲菊酯；土傳病害防治中的作用[16]，從草莓田土壤中分離獲得2株貝萊斯芽孢桿菌，盆栽和田間試驗結果表明，其可有效防治草莓枯萎病[17]；土壤修復中的作用，在土壤鹽漬化和石油污染的土壤中添加菌劑和營養鹽，經過2個月修復，土壤中石油降解率能達到67.7%[18]。

新疆土壤有益微生物更易適宜本地土壤環境，易于在土壤中定植與繁殖并持續發揮作用[19]。研究中貝萊斯芽孢桿菌JTB8-2分離自新疆本地加工番茄田間，其在盆栽試驗及田間試驗中均表現出較好的促生和增產作用，該菌株能夠有效在加工番茄根際定植與繁殖。但是其在土壤及加工番茄根際定植與繁殖情況仍需進一步深入研究。

貝萊斯芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個新種，近年來，對該菌種在促進植物生長、防病和系統誘導抗性方面進行了研究，施用貝萊斯芽孢桿菌B006菌劑處理的盆栽茄子株高、莖粗、根長和根干質量比對照分別提高了16.7%、20.7%、28.7%和67.0%，溫室土壤中施用B006菌劑處理的茄子產量比對照分別提高了24.5%和18.1%[12]；貝萊斯芽孢桿菌菌株S6可濕性粉劑400倍液、800倍液、1 200倍液對番茄早疫病和灰霉病的防效均在70%以上，對番茄葉霉病的防效在50%以上，對番茄晚疫病的防效在54%以上[20]；貝萊斯芽孢桿菌LJ02菌株能夠誘導黃瓜等植物產生免疫抗病反應[21]。研究中貝萊斯芽孢桿菌JTB8-2對加工番茄具有顯著的促生作用，但其最佳用量及對加工番茄的促生作用機制需要繼續開展研究。

4 結 論

貝萊斯芽孢桿菌JTB8-2發酵液原液對20中作物種子萌發和芽生長具有抑制作用，但是其25倍及以上稀釋液對20種作物種子萌發和芽生長無影響。該菌株發酵液能夠顯著促進加工番茄根系和莖生長，且其50倍液促生效果最佳。加工番茄苗期使用50倍貝萊斯芽孢桿菌JTB8-2菌株發酵液進行澆灌可取得較好促生效果。