火神山醫院新冠肺炎預防經典方中12 種主成分的含量測定

宋新華，梁鳳英，許封菁，劉艷平，王志鵬，陳萬生

新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎，COVID-19）是一種急性感染性肺炎，其病原體是一種先前未在人類中發現的新型冠狀病毒，簡稱“新冠肺炎”。患者以發熱、干咳、乏力為主要表現的急性傳染病，人群普遍易傳染［1］。中醫學認為“正氣存內，邪不可干”，在常規預防的同時，早期進行中醫藥干預可避免疫癘之邪的侵入和傳變，從而達到“未病先防，既病防變”的作用。疫情期間全國多個城市紛紛采用中藥對患者進行治療，并且效果顯著［2］。在火神山醫院病區中醫中藥治療率達100%，純中醫治療率達75%［3］。中醫治療采用辛溫解表之法溫散、透寒邪，通過芳香避穢化濁治療濕邪，同時調理脾胃來針對寒濕疫。根據患者的體質、病情、當地氣候特點等，辨證施治［4］。新冠肺炎預防經典方為武漢火神山醫院依據國家衛健委印發的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》所引進的4 種肺炎診療中藥湯劑處方之一，用于新型冠狀病毒預防治療。使用液相色譜-三重四極桿串聯質譜（HPLC-MS/MS）技術進行分析，因其具有分離效果好、靈敏度高、抗干擾能力強、選擇性好等優點［5］。

火神山醫院新冠肺炎預防經典方由黃芪、麩炒白術、防風、貫眾、金銀花、陳皮、佩蘭等7 味藥材的主成分為指標，對其中12 種主成分（黃芪甲苷、升麻苷、木犀草苷、金絲桃苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術內酯-Ⅲ）進行含量測定，建立超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）法進行含量測定，為火神山醫院新冠肺炎預防經典方的質量控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1200 系列高效液相色譜儀（HPLC）由美國安捷倫科技公司制造（Agilent Technologies，美國），由G1311A 型四元泵、G1322A 型真空脫氣機、G1329A 型自動進樣器和G1316A 型柱溫箱等組成。安捷倫6410A三重四極桿串聯質譜儀由美國安捷倫科技公司制造（Agilent Technologies，美國），離子源為ESI 型，數據采集及處理系統采用MassHunter 軟件。定時可調速旋渦混合器（美國labnet 公司），Eppendorf 5418R 型臺式冷凍高速離心機（德國Eppendorf 公司），百萬分之一電子天平，MES3.6P-0CE0DM 型（賽多利斯，哥廷根，德國，最大稱重3.1 g，分辨率0.001 mg）；單通道移液槍，Reaserch plus 型，量程10、20、100、200、1 000 μl（艾本德，漢堡，德國）。超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司，SK7200H 型）。旋渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，Vortex QL-901 型），煎藥壺（蘇泊爾液體加熱器，SW-30Y06），灌裝針頭式濾器（上海泰坦科技股份有限公司，聚醚砜PES，0.22 μm，13 mm）。

新冠肺炎預防經典方3 批（黃芪15 g、麩炒白術9 g、防風9 g、貫眾6 g、金銀花9 g、陳皮6 g、佩蘭9 g，上海長征醫院中藥房提供）。黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，批號：J25F10T81373）、毛蕊異黃酮苷（Calycosin7-O-glucoside，批號：Y13F11H108672）、毛蕊異黃酮（Calycosin，批號：Y24N9Y75652）、刺芒柄花苷（Ononin，批號：P03A10F84910）、白術內酯-Ⅲ（Atractylenolide Ⅲ，批號：M13D10S105676）、升麻苷（Prim-O-glucosylcimifugin，批號：Y31M9H62747）、亥茅酚苷（Sec-O-glucosylhamaudol，批號：Y02A7H1887 4）、升麻素（Cimifugin，批號：Y11O9H72162）、桔皮素（Tangeretin，批 號：H24F11K108893），川 陳 皮 素（Nobiletin，批號：N10J10R90249）、木犀草苷（Cynaroside，批號：Y13J10H93050），金絲桃苷（Hyperoside，批號：Y08N9X74602）、利血平（Reserpine，批號：Y02M11Y17235）對照品，均由上海源葉有限公司提供。質譜純甲醇（Merck 公司，德國），質譜純乙腈（Merck 公司，德國），色譜純甲酸（天地公司，美國），蒸餾水（屈臣氏，中國）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm，Agilent，USA）。流動相：A 相0.1%甲酸乙腈溶液：B 相0.1%甲酸和10 mmol/L 醋酸銨水溶液。流速：0.3 ml/min。進樣量：5 μl，柱溫：40°C。運行時間：7.2 min。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.2 質譜檢測條件 選用電噴霧（ESI）離子源，監測模式選擇正離子模式分析，質譜噴霧針電壓（Capillary）設置為4 000 V，離子源溫度設置為350 ℃。霧化氣及干燥氣選用氮氣（N2），碰撞池所用氣體為高純氮氣（N2），設置壓力為0.1 MPa；其他質譜參數優化結果如下：霧化氣壓力設置為40 psi；MS1和MS2的加熱溫度均為105 ℃；氣體流速設置為10 ml/min，掃描方式為多重反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）。將一定濃度的對照品溶液和內標溶液進樣，ESI 電離方式下，進行產物離子全掃描分析，隨后對單個分析物的F值和CE 值進行優化，選擇最優的F值和CE 值后，確定其子離子。用于定量分析的參數見表2。

表2 新冠肺炎預防經典方12 種主成分及內標質譜條件

分別對黃芪甲苷、升麻苷、金絲桃苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術內酯-Ⅲ和內標利血平母離子進行產物離子全掃描分析，并將以上碎片離子作為定量分析時監測的產物離子。見圖1。

圖1 新冠肺炎預防經典方中12 個主成分及內標的二級產物離子圖

1.2.3 對照品溶液的制備 依次精密稱取黃芪甲苷、升麻苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術內酯-Ⅲ、利血平（內標）標準品2.02 mg、2.02 mg、2.02 mg、2.02 mg、2.06 mg、2.04 mg、2.01 mg、2.03 mg、2.02 mg、2.03 mg、2.06 mg，分別置于2 ml容量瓶中，以純甲醇定容至刻度，搖勻，得儲備液，分裝后儲存于-20 ℃的冰箱中。精密稱取2.01 mg木犀草苷，置于2 ml 容量瓶中，加入少量二氯甲烷溶解，然后用純甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到對照品的儲備液，分裝后置于-20 ℃冰箱保存。精密稱取2.03 mg 金絲桃苷，置于2 ml 容量瓶中，加入少量二甲基亞砜DMSO 溶解，然后用純甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到對照品的儲備液，分裝后置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 供試品溶液的制備 取預防經典方中黃芪15 g、麩炒白術9 g、防風9 g、貫眾6 g、金銀花9 g、陳皮6 g、佩蘭9 g，置于容器中加入800 ml 水浸泡30 min，再用煎藥壺（蘇泊爾液體加熱器，SW.30Y06）煎煮100 min，冷卻后倒出濾液混勻約300 ml，取1 ml 濾液，加入10 μg/ml 的利血平10 μl，渦旋混勻3 min，室溫，13 500 r/min 條件下離心10 min 后取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜后，取續濾液進樣分析。

1.3 方法學考察

1.3.1 專屬性 專屬性（specificity）指所建立的方法能從樣本中準確選擇待測化合物并同其余雜質區分的能力。取12 種化合物適量，隨后再用純甲醇稀釋，制得黃芪甲苷濃度為0.2 μg/ml、升麻苷濃度為2.0 μg/ml、木犀草苷濃度為0.2 μg/ml、金絲桃苷濃度為2.0 μg/ml、毛蕊異黃酮苷濃度為0.1 μg/ml、亥茅酚苷濃度為0.2 μg/ml、刺芒柄花苷濃度為0.1 μg/ml 苷、川陳皮素濃度為0.2 μg/ml、桔皮素濃度為0.1 μg/ml、升麻素濃度為0.2 μg/ml、毛蕊異黃酮濃度為0.1 μg/ml、白術內酯-Ⅲ濃度為0.1 μg/ml的定量下限（LLOQ）濃度。同上制作利血平（內標）的標準品樣本。取來自3 份不同試劑瓶的甲醇和供試品樣本，按照“1.2.4 供試品溶液的制備”所述方法進行處理后進樣分析。待測化合物及內標的響應不超過LLOQ 樣本響應的20% 及內標響應的5%時即為合格。

1.3.2 精密度實驗 取同一對照品溶液，根據“1.2.1”項下色譜條件進行測定，重復進樣6 次，并記錄峰面積。相對峰面積的RSD%在15%以內，表明進樣儀器的精密度良好。

1.3.3 重復性實驗 取預防經典方一批，按照“1.2.4”項平行制備6 份供試品溶液，測定在“1.2.1”項色譜條件下的相對保留時間和相對峰面積。相對保留面積RSD%在15% 以內。表明該實驗方法的重復性良好。

1.3.4 穩定性實驗 取預防經典方一批，并根據“1.2.4”項下平行制備6 份供試品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下，分別記錄0、2、4、8、24 h 的相對保留時間和相對峰面積。相對保留面積RSD%在15%以內。表明供試樣品溶液在24 h 內穩定性好。

2 結果

2.1 方法學考察結果

2.1.1 專屬性考察結果 取12 種化合物適量，隨后再用純甲醇稀釋，制得最低定量下限濃度樣本，見圖2。同上制作利血平（內標）的標準品樣本，見圖3。取來自3 份不同試劑瓶的甲醇和供試品樣本，按照“1.2.4 供試品溶液的制備”所述方法進行處理后進樣分析，見圖4。待測化合物及內標的響應均不超過LLOQ 樣本響應的20% 及內標響應的5%，專屬性考察合格。

圖2 空白色譜圖

圖3 內標色譜圖

圖4 最低定量限色譜圖

2.1.2 線性考察結果 按照“1.2.3”項下制備標準品溶液，得到混合對照品色譜圖。將標準品儲備液用純甲醇稀釋，黃芪甲苷、升麻素、木犀草苷、亥茅酚苷、川陳皮素濃度梯度為：0.2、0.5、1、2、5、8、10 μg/ml；毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花苷、桔皮素、毛蕊異黃酮、白術內酯-Ⅲ濃度梯度為：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 μg/ml；升麻苷、金絲桃苷濃度梯度為：2、4、6、8、10、20、50 μg/ml；在“1.2.1”項色譜條件下，分別記錄12 種有效成分的峰面積，以峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，結果見表3。

表3 線性考察結果

2.1.3 精密度實驗結果 取同一對照品溶液，根據“1.2.1”項下色譜條件進行測定，重復進樣6 次，并記錄峰面積。黃芪甲苷、升麻苷、金絲桃苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術內酯-Ⅲ的峰面積RSD%分別為3.72%、0.85%、2.16%、2.11%、1.62%、0.94%、1.11%、0.72%、0.89%、1.35%、1.13%、0.48%，均小于15%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩定性實驗結果 取同一供試品溶液，并根據“1.2.1”項色譜條件在0、2、4、8、24 h 測定。黃芪甲苷、升麻苷、金絲桃苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術內酯-Ⅲ的峰面積RSD%分別為5.73%、1.24%、5.72%、8.43%、2.84%、1.37%、3.03%、5.67%、6.91%、2.64%、5.33%、3.11%，均小于15%，表明供試品在24 h 內穩定。

2.1.5 重復性實驗結果 取同一供試品溶液，按照“1.2.4 供試品溶液的制備”項下條件，平行制備6 份樣品，并根據“1.2.1”項色譜條件進行測定，黃芪甲苷、升麻苷、金絲桃苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術內酯-Ⅲ的峰面積RSD 分別為3.53%、7.53%、5.97%、8.43%、4.73%、4.15%、3.75%、5.37%、3.85%、4.02%、8.17%、1.53%，均小于15%，表明系統重復性良好。

2.1.6 加樣回收率 精密量取預防經典方溶液0.5 ml，加入各對照品適量，平行制備6 份，按“1.2.4”項方法制備供試品溶液，并根據“1.2.1”項的色譜條件進行分析，計算各待測物的平均回收率，按照“回收率=（實測量－樣品含量）/加入量×100%”公式計算加樣回收率，黃芪甲苷、升麻苷、金絲桃苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術內酯-Ⅲ的平均加樣回收率分別為107.57%、106.55%、100.59%、110.61%、106.68%、92.68%、112.46%、85.39%、109.46%、99.08%、101.47%、96.61%。

2.2 樣品含量測定

取3 批預防經典方藥方，按“1.2.4 供試品溶液的制備”項制備樣本，按“1.2.1 色譜條件”項色譜條件測定黃芪甲苷、升麻苷、金絲桃苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術內酯-Ⅲ的含量，測定結果見表4。

表4 3 批新冠肺炎火神山預防經典方樣品中12 種有效成分的測定結果

3 討論

3.1 供試品溶液的制備

火神山醫院新冠肺炎預防經典方由黃芪、麩炒白術、防風、貫眾、金銀花、陳皮、佩蘭等7 味中藥組方而成，黃芪具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功效，近年研究表明，黃芪主要含黃芪多糖、黃芪皂苷和黃酮類成分，具有增強免疫系統功能、抗心肌缺血、雙向調節血壓、保護血管內皮細胞、保肝、抗腫瘤、清除自由基和抗衰老等作用［6］。白術的干燥根莖，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之效［7］。主治脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動不安等癥［8］。近年來的研究表明白術具有利尿、抗菌、抗衰老、抗腫瘤等作用，對神經系統、子宮平滑肌、腸胃運動也有一定作用，還能調節免疫功能［9］。防風主要具有解熱、鎮痛、鎮靜、抗炎、抗菌、抗腫瘤、提高機體免疫功能、抗過敏、抗凝血等藥理作用［10］。貫眾具有清熱解毒、驅蟲、涼血、止血等作用。臨床上用于治療風熱感冒，濕熱癍疹、吐血、便血及崩漏等疾病［11］。金銀花具有抗炎、解熱、抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗氧化、抗血小板聚集、抗腫瘤、增強免疫力等作用，臨床應用時應結合具體病情，選用適宜的配伍方案，以取得最佳的治療效果［12］。陳皮味苦、辛，性溫，歸肺、脾經。具理氣健脾、燥濕化痰之功［13］。佩蘭用于濕濁中阻，脘痞嘔惡，口中甜膩，口臭，多涎，暑濕表證，濕溫初起，發熱倦怠，胸悶不舒［14］。中藥中主成分對治療新冠肺炎起著重要的作用，中藥的煎煮對實驗的成功起著重要的作用。將中藥置于容器中加入800 ml 水浸泡30 min，再用冷卻的煎藥壺煎煮100 min，待藥液冷卻后倒出濾液混勻約300 ml，煎藥過程中嚴格把控加入水量、浸泡時間、煎煮時間。

3.2 內標的選擇

在預實驗中分別考察了苯甲酸、卡馬西平、利血平3 個標準品作為內標，根據3 個內標的響應和出峰時間，最終選用了出峰時間居中、響應好、穩定性高的利血平作為內標。

3.3 色譜柱的選擇

使用乙腈-0.1% 甲酸水溶液（60∶40）作為流動相，分別選用ZORBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm，Agilent，USA），顯示化合物出峰過早，該柱對化合物的保留效果較差。Xbridge?HILIC（2.1 mm×100 mm 3.5 μm，Waters，USA），顯示化合物出峰較晚，該柱對化合物的保留時常較長，不宜選用。ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150 mm 3.5 μm，Agilent，USA），顯示化合物出峰較晚，該柱對化合物的保留較長，不宜選用。ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm 3.5 μm，Agilent，USA），顯示化合物出峰時間適宜，符合選用標準。

3.4 流動相的選擇

實驗考察了乙腈-0.1% 甲酸水溶液作為流動相，結果顯示峰形有拖尾現象，增加水相中的甲酸濃度至0.2% 的流動相，酸性的增強抑制了酸性化合物的電離，保留時間增加，酸性化合物出現拖尾，而堿性化合物拖尾改善，但有峰裂分現象，隨后選用0.1%甲酸-10 mmol/L 醋酸銨水溶液-乙腈，所有化合物的峰形均有改善，堿性化合物略有拖尾現象，峰形無裂分，進一步優化流動相為0.1% 甲酸-10 mmol/L 醋酸銨水溶液-0.1%甲酸乙腈，結果顯示所有化合物峰形較好，無拖尾、峰裂分現象。

4 結論

實驗建立了一種快速、靈敏、穩定的UHPLCMS/MS 方法，方法學驗證結果表明專屬性、線性、重復性、穩定性、精密度、加樣回收率結果均符合要求。本法操作簡單、可靠，適用于測定新冠肺炎預防藥方寒濕郁肺湯中12 種主成分的含量測定，為火神山醫院新冠肺炎預防經典方的質量控制提供科學依據。