泰地羅新注射液在豬體內的殘留消除研究

耿智霞，賈 興，瞿紅穎，宋婷婷，劉 靜，郭李珉，魏麗娟*，曹興元

（1. 河北遠征藥業有限公司，河北石家莊050041；2. 河北省獸藥技術創新中心，河北石家莊050041；3. 中國農業大學動物醫學院，北京100193）

泰地羅新（tildipirosin）是英特威-先靈葆雅公司開發的新一代的大環內酯類半合成抗生素，為泰樂菌素的衍生物[1-2]。與其他大環內酯類藥物類似，泰地羅新是時間依賴性的抗菌藥，可以選擇性地結合核糖體亞單位，抑制細菌合成必要的蛋白質。泰地羅新是動物專用的廣譜抗菌藥，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有較高的抗菌活性，對引起豬、牛呼吸系統疾?。˙RD）的病原菌如溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌等敏感性高[3-7]。

泰地羅新藥效作用強于泰樂菌素、替米考星，在臨床使用過程中具有給藥劑量低、半衰期長、藥效持久且生物利用度高等眾多優點[8-10]，在養殖業中具有非常廣闊的應用前景。本試驗評價泰地羅新注射液給靶動物豬肌注給藥后在靶組織中和注射給藥部位的殘留消除規律，以期為確定制劑的休藥期以及其他相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑

泰地羅新對照品（含量98.7%，批號：20161128，河北遠征藥業有限公司自制）、泰地羅新-D10對照品（批號：20-THT-35-5，Toronto Research Chemicals Inc.）、泰地羅新注射液（批號：TILDI-1-03，河北遠征藥業有限公司）；乙腈、甲醇、正己烷與甲酸（色譜純，Merck）；磷酸氫二鈉、氫氧化鈉均為分析純。

1.1.2 主要儀器

Acquity UPLC-TQD液相色譜-串聯質譜儀（Waters）、MS105DU 分析天平（感量0.000 01g，Mettler Toledo）、JY5002 天平（感量0.01g，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）、AM-2 組織勻漿機（Nissei 公司）、TGL-15B 高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）、HMA-50A渦旋混合器（天津恒奧科技發展有限公司）、固相萃取裝置（Waters Corporation）、N-Evap 112 氮 吹 儀（Organomation Associates Inc）、Oasis HLB固相萃取柱（Waters Corporation）。

1.1.3 溶液配制

精密稱取10 mg 泰地羅新對照品于10 mL 容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，即得濃度為1 g/L 的泰地羅新標準貯備液。分別精密量取上述貯備液1.0、0.1 mL 于10 mL 容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，即得成濃度為100、10 μg/mL的標準工作液。

1.1.4 試驗動物

試驗動物為26頭三元雜交健康豬，由北京畜牧總站試驗豬場提供。給予不添加抗菌藥物的飼料，自由飲水。

1.2 試驗方法

1.2.1 給藥及采樣

隨機選擇26 頭健康豬，其中2 頭豬不用藥，24 頭豬均按4 mg/kg·BW 劑量肌注給藥。2 頭不用藥豬在給藥后12 h進行屠宰，24頭給藥豬分別在給藥后12 h以及3、6、9、12、15 d 隨機選擇4 頭進行屠宰，屠宰后快速采集肌肉、肝臟、腎臟和脂肪等組織樣品，以建立的UPLC-MS/MS方法測定所取組織樣本中泰地羅新的殘留量。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 提取

稱?。?.00±0.02）g 試料，置于50 mL 離心管，加入適量泰地羅新-D10內標工作液，再加入乙腈5 mL，渦旋混勻，振蕩提取10 min，8 000 r/min 離心5 min，轉移上清液。殘渣中再加入乙腈5 mL，重新提取一次，合并兩次提取液于另一離心管中，50 ℃水浴下氮吹濃縮近干。

1.2.2.2 凈化

在上述殘留物中加入磷酸鹽緩沖溶液8 mL，渦旋混勻，超聲5 min，采用微孔濾膜過濾。在上述溶液中加入正己烷5 mL，渦旋混勻，5 000 r/min 離心5 min，棄去上層有機相，保存下層水溶液。采用甲醇5 mL、磷酸鹽緩沖液5 mL活化固相萃取柱，取備用液過柱；采用磷酸鹽緩沖液5 mL、5%甲醇水溶液淋洗，真空泵抽干5 min，加入甲醇5 mL 進行洗脫。將洗脫液在50 ℃水浴條件下氮吹近干。加入含0.1%甲酸的乙腈-水溶液（5∶95）2.0 mL，渦旋混勻，0.2 μm濾膜過濾，采用液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.3 色譜條件

1.2.3.1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18（50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm）或相當者；流動相A：0.1%甲酸的乙腈溶液；流動相B：0.1%甲酸的水溶液。梯度洗脫：在0、3.0、4.5、6.0 min時，流動相A依次為5%、30%、90%、5%；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.2.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描（ESI+）；檢測方式：多反應監測（MRM）；毛細管電壓：1.5 kV；源溫：120 ℃；脫溶劑氣溫度：380 ℃；脫溶劑氣流量：500 L/h；碰撞室：氬氣3.0×10-3mbar；定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞電壓條件見表1。

表1 泰地羅新和泰地羅新-D10特征離子參考質譜條件Tab.1 Reference MS conditions for tildipirosin and tildipirosin-D10 characteristic ions

特征離子對/(m/z)735.1＞98.1 735.1＞174.2定量離子對/(m/z)735.1＞98.1錐孔電壓/V 86碰撞能量/eV 46 60

1.2.4 方法確證

1.2.4.1 特異性取不同來源的肌肉、肝臟、腎臟空白樣品，確定在相應的保留時間對泰地羅新檢測是否存在干擾。

1.2.4.2 標準曲線的制備

準確量取適量泰地羅新和泰地羅新-D10標準工作液，采用含0.1%甲酸的乙腈-水溶液（5∶95）稀釋成泰地羅新濃度分別為5、20、50、200、500、1 000 μg/L 的標準溶液（內標物濃度200 μg/L），供液相色譜-串聯質譜儀測定。

以泰地羅新標準溶液的濃度為橫坐標，以泰地羅新定量離子的峰面積與內標定量離子峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4.3 靈敏度

在2 g 空白試料中添加適量的標準工作液，進樣檢測后，計算信噪比，確定檢測和定量限，考察方法的靈敏度。

1.2.4.4 準確度與精密度

在豬肌肉、肝臟、腎臟和脂肪空白樣品中添加3個不同濃度的泰地羅新，分別為定量限、1/2 最高殘留量（MRL）、MRL）進行空白添加回收率試驗。每個濃度設6個平行樣品，重復試驗3批，計算回收率及批內、批間相對標準偏差，考察方法的準確度和精密度。

2 結果與分析

2.1 方法學驗證

2.1.1 特異性處理豬肌肉、脂肪、肝臟、腎臟空白樣品及各組織中添加泰地羅新，目標化合物的保留時間附近無雜質干擾。

2.1.2 線性范圍

以泰地羅新標準溶液的濃度為橫坐標，以泰地羅新定量離子的峰面積與內標定量離子峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為：y=0.874 907x+15.218 7，相關系數r為0.999 9，表明藥物在5～1 000 μg/L 的濃度范圍內，峰面積與濃度線性關系良好。

2.1.3 靈敏度

泰地羅新在豬肌肉、脂肪、肝臟和腎臟中的檢測限為5 μg/kg，在肌肉和脂肪中的定量限為10 μg/kg，在豬肝臟和腎臟中的定量限為20 μg/kg。

2.1.4 準確度和精密度考察

在豬肌肉、脂肪、肝臟和腎臟空白樣品中添加定量限、1/2 MRL、MRL 濃度的泰地羅新，進行空白添加回收率試驗。結果表明，在不同添加濃度水平下，泰地羅新在肌肉、肝臟、腎臟、脂肪中的檢測回收率范圍為90.2%～108.0%、81.5%～92.3%、82.3%～93.5%和88.5%～102.0%，批內相對標準偏差小于10%，批間相對標準偏差小于15%。

2.2 肌注給藥后組織中泰地羅新的濃度（見表1、圖1、圖2）

由表1及圖1、圖2可知，按4 mg/kg·BW劑量肌注給藥后，泰地羅新在豬各組織中代謝緩慢，豬肌肉、注射部位、肝臟及腎臟組織分別在給藥后12 h泰地羅新殘留量最高，并逐漸消除，肌肉、肝臟和腎臟組織中泰地羅新在給藥后12 h低于MRL值，注射部位泰地羅新殘留量在給藥6 d后低于MRL 值，脂肪組織在給藥后3 d 泰地羅新殘留量最高，在給藥6 d后泰地羅新殘留量低于MRL值。

在初始采樣時間，泰地羅新在豬各組織中的濃度由高到低為：腎臟＞注射部位＞肝臟＞脂肪＞肌肉；在給藥后15 d，泰地羅新在各組織濃度由高到低為：腎臟＞注射部位＞肝臟＞脂肪＞肌肉。

表2 豬組織樣品中泰地羅新的濃度Tab.2 Concentration of tildipirosin in pig tissue samples 單位：μg/kg

2.3 休藥期

參照歐盟制定的泰地羅新在豬體內的MRL，泰地羅新在豬肌肉、脂肪、肝臟、腎臟和注射部位的MRL 值分別為1 200、800、5 000、10 000和7 500 μg/kg。

經休藥期計算軟件WT1.4 計算，肌肉、脂肪、肝臟、腎臟中的休藥期分別為1.17、9.75、0、2.17 d。結合肌肉、脂肪、肝臟、腎臟中的休藥期，將泰地羅新在豬組織中的休藥期定為10 d，10 d內注射部位泰地羅新的濃度均低于注射部位的MRL值7 500 μg/kg。

3 討論

豬呼吸道疾病是全球范圍內普遍發生的疾病，其發病率和病死率仍逐年上升，對全球養豬業造成了一定的經濟損失[11-12]。豬呼吸道疾病病因復雜，病原眾多（包括豬胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、多殺巴氏桿菌、鏈球菌、波氏桿菌、圓環病毒、偽狂犬病毒、豬流感病毒、豬瘟病毒、豬后圓線蟲、支原體等），易受到轉群運輸、極端天氣、室內溫濕度、飼養密度、代謝紊亂、免疫低下等多種因素影響，具有發病率高、病死率高、飼料報酬率低和經濟損失嚴重等特點。因該病病原與誘因較多和易混合感染，難以避免其發生和流行。

目前，針對豬呼吸道疾病的治療方式是給予抗菌藥物，泰樂菌素和替米考星等大環內酯類抗生素均有具有較好的治療效果[13]。但隨著大環內酯類等藥物的耐藥性問題日趨嚴重，開發新的廣譜、高效、優質且安全的抗菌藥物勢在必行。泰地羅新作為最新動物專用的大環內酯類半合成抗生素，泰地羅新吸收快、達峰時間短、生物利用度高、肺組織濃度高、消除半衰期長、藥效持久。單次肌注或皮下注射給藥即可提供全程治療，在獸醫臨床具有廣闊的應用前景[14-16]。

在本試驗中，泰地羅新按4 mg/kg·BW肌注給藥后，在豬體內消除較慢，在腎臟中的殘留濃度最高、殘留時間最長。歐盟規定，泰地羅新在豬的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟和注 射 部 位的MRL 分 別 為1 200、800、5 000、10 000 和7 500 μg/kg。采用WT1.4 休藥期軟件對肌注泰地羅新后的休藥期進行計算，肌肉、脂肪、肝臟、腎臟中的休藥期分別為1.17、9.75、0、2.17 d。結合肌肉、脂肪、肝臟、腎臟中的休藥期，將泰地羅新在豬組織中的休藥期定為10 d。國外同類產品在豬肌肉和內臟中的休藥期為9 d，與本次試驗結果基本一致。

4 結論

建立的豬組織樣品中泰地羅新殘留的超高效液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）檢測方法適用于豬組織樣品中泰地羅新殘留檢測。建議豬肌注泰地羅新注射液后休藥期定為10 d。