云南某豬場6 種疾病混合感染的診斷

李永薈，舒相華，袁 紅，解水梅，耿志誠，張王芝，林鈞藝，宋春蓮

（云南農業大學動物醫學院，云南昆明650201）

近年來，隨著生豬養殖不斷朝向規模化發展，多種疾病混合感染的現象愈發頻繁，對豬場常見疾病診斷與防控提出了新要求。豬圓環病毒病（PCVD）和豬藍耳病（PRRS）均為免疫抑制性疾病，可導致母豬繁殖障礙疾病以及仔豬和育肥豬呼吸系統疾病[1-2]；豬支原體肺炎（MPS）是一種發病率高、病死率低的豬慢性呼吸道傳染病[3]；大腸桿菌可引起仔豬白痢、仔豬黃痢、豬水腫病、敗血癥及新生仔豬腹水等多種疾病，發病率和病死率均較高[4-5]；豬葡萄球菌病能夠引起滲出性皮炎，以哺乳仔豬和保育豬易發，發病率為10%～90%，病死率可達到70%左右[6]；沙門氏菌病主要表現為敗血癥和壞死性腸炎，一年四季均可發生，按病程可分為急性、亞急性、慢性型，4月齡內的豬易感[7]。

目前針對PRRS、PCVD、豬瘟（CSF）等疾病，臨床常用檢測方法如ELISA、PCR 等能夠快速有效地進行診斷[3,8]。有研究表明，感染豬藍耳病病毒（PRRSV）的情況下，發生與豬圓環病毒2（PCV-2）混合感染的概率高于其他傳染病[9]。PRRSV 與PCV-2 混合感染后可引發機體免疫系統紊亂和免疫抑制以及炎癥反應，導致其他細菌或病毒混合感染的概率升高。若存在多種病毒病混合感染且伴隨腸道細菌感染并擴散至其他內臟，可出現二次感染造成豬死亡[10-11]，增加豬的病死率。目前尚無針對病毒性疾病有效藥物和方式治療，養殖場仍以疫苗接種方式進行預防。本試驗對云南某豬場發生的PCV-2、PRRSV、豬肺炎支原體（Mhp）與大腸桿菌、葡萄球菌和沙門氏菌的混合感染病例進行實驗室診斷，為養殖場提供防治建議。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本采集

來自云南省鎮沅縣某豬場的100頭母豬血樣、60頭保育豬血樣以及2頭保育豬新鮮脾臟和肺臟組織。

1.1.2 試劑與儀器

主要試劑：PRRSV、PRV-gB、PRV-gE、PCV-2-dCap、豬瘟病毒（CSFV）阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒（武漢科前生物股份有限公司）；核酸提取試劑、反轉錄試劑（寶生物工程（大連）有限公司）；瓊脂糖凝膠（北京擎科生物科技有限公司）。

主要儀器：酶標儀（廣州秦思科學儀器有限公司）、烘干箱（上海一恒科學儀器有限公司）、離心機（艾本德股份公司）、PCR 擴增儀（耶拿公司）、電泳儀（北京六一儀器廠公司）、凝膠成像分析儀器（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗體檢測

取全血待血液凝固，4 000 r/min 離心10 min，收集血清。使用ELISA 抗體檢測試劑盒對160 份血樣進行CSFV、PCV-2、PRRSV、PRV-gB、PRV-gE 的檢測，方法參考試劑盒說明書。

1.2.2 病原檢測

分別從100頭母豬和60頭保育豬中各隨機抽取5份血樣（共10份），2頭保育豬肺臟和脾臟組織。

10 份血樣和2 頭保育豬組織分別采用本實驗室建立的PCR 方法進行檢測鑒定PCV-2、PRRSV、PRV、Mhp、CSFV、胸膜肺炎放線桿菌（APP）、副豬嗜血桿菌（HPS）和巴氏桿菌（PeP）的病原。鑒定引物均由本實驗室設計，上海生工生物科技有限公司合成。各鑒定引物序列見表1。

表1 病毒與細菌核酸檢測引物序列Tab.1 Primer sequences for virus and bacterial nucleic acid detection

1.2.3 細菌分離培養

2頭保育豬新鮮脾臟和肺臟組織分別在LB培養基、麥康凱培養基、SSS培養基和血平板進行細菌分離培養后染色鏡檢。

1.2.4 組織病理切片觀察

將新鮮的脾臟、肺臟浸泡于10%甲醛溶液固定，修塊、梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成厚度為4 μm的連續切片；烤片干燥，采用二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色，鹽酸酒精分色，自來水沖洗淡化；伊紅酒精染色，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，拍照記錄組織病理學變化。

2 結果與分析

2.1 不同病毒抗體水平檢測結果（見圖1）

由圖1 可知，母豬和保育豬PRV-gB、PSSRV、CSFV、PCV-2 免疫抗體陽性率均高于90%；保育豬PRV-gB、PCV-2 免疫抗體陽性率高于90%，CSFV 抗體陽性率高于80%，PRRSV 免疫抗體陽性率僅為46.70%。母豬和保育豬的PRV-gE抗體陽性率均為0。

2.2 病原檢測結果（見圖2～圖4）

由圖2～圖4 可知，5 份母豬血樣PCR 檢測PRRSV、PRV、PCV-2、CSFV、PeP、Mhp、HPS 和APP 病原的結果均為陰性。5頭保育豬血樣和2頭保育豬組織PCR檢測結果分別為：1 頭保育豬血樣和1 頭保育豬組織PCV-2 陽性，5 頭保育豬血樣和2 頭保育豬組織PRRSV 均為陽性，1 頭保育豬組織Mhp陽性。

2.3 細菌分離培養染色鏡檢結果（見圖5）

2頭保育豬組織細菌分離培養后，LB培養基上有乳白色光滑菌落生長。

由圖5 可知，2 頭保育豬組織均存在大腸桿菌，其中1頭組織存在葡萄球菌，另1頭存在沙門氏菌。

2.4 病理組織切片結果（見圖6）

由圖6 可知，低倍鏡下可見豬肺臟呼吸部整體結構發生破壞；高倍鏡下可見肺泡內充滿紅色黏液，存在出血現象，肺泡囊消失，肺泡巨噬細胞減少，Ⅰ型細胞和Ⅱ型細胞變形。低倍鏡下可見脾臟小梁變寬，間質、竇腔增寬，紅髓區與白髓區界限不清，脾小體消失，呈明顯出血現象；高倍鏡下可見脾臟淋巴細胞變小，漿細胞變大。

3 討論

隨著我國集約化和規模化養殖增多，多病原混合感染的情況也日益增多。PRRS和PCVD均為能夠造成免疫抑制而導致免疫應答不充分的豬群常見疾病。近年來，PRRSV和PCV混合感染的案例有所增加并引起了人們的廣泛關注。當PRRSV 和PCV 進入豬體內，可相互促進病毒復制，導致豬群出現嚴重的呼吸道癥狀和繁殖障礙疾病[12]。有研究表明，PRRSV 和PCV 的混合感染不僅能夠侵害呼吸系統，還可降低機體免疫力，引起生長發育遲緩，進而導致支原體肺炎、胸膜肺炎等細菌病的混合感染概率升高[13-14]。

本研究中，該豬場出現PRRSV、PCV、Mhp 與葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌混合感染的情況。有研究表明，保育豬在感染PRRSV 和PCV 后存在分別與沙門氏菌、葡萄球菌、支原體發生混合感染的情況[15-16]，發生大腸桿菌的繼發感染的情況則在仔豬中較為常見[17]。上述結論與本研究結果中出現混合感染情況有所不同，可能由于該豬場的豬群在出現PRRSV 和PCV 的混合感染后免疫力下降，且場內環境清潔不到位、養殖密度大等導致繼發支原體、沙門氏菌、葡萄球菌和大腸桿菌感染。

研究表明，在發生PRRSV和PCV的混合感染后，肺小葉間質增寬，充滿大量紅色漿液，小血管和毛細血管擴張，充滿紅細胞，肺泡腔內有大量紅染漿液和纖維蛋白[18-19]；脾臟實質細胞壞死明顯，小梁尚可分辨，脾小體輪廓不清，但淋巴細胞和網狀細胞崩解、碎裂，在白髓和紅髓均可見大量紅細胞蓄積和巨噬細胞增生[20-21]。上述病理變化與本研究中病例剖檢所見相同。

本試驗中，母豬群抗體檢測結果均免疫合格，保育豬PRRSV 免疫抗體陽性率低于80%，為免疫不合格，結合抗原檢測有PRRSV檢出，表明豬場已經感染該病，保育豬免疫抑制引起免疫抗體不合格和發病；PCV-2免疫抗體陽性率均高于90%，結合有抗原檢出，表明免疫抗體可能是野毒感染所致；PRV-gE抗體陽性率為0，抗原檢測未檢測到病原，表明該場內不存在PRV野毒感染情況。

4 結論

經檢測，該豬場存在PRRSV、PCV、Mhp、大腸桿菌、沙門氏菌和葡萄球菌的混合感染，建議豬場加強生物安全消毒工作，同時使用抗生素結合提高免疫力的藥物進行治療與保健。PRRS 和PCVD 均為免疫抑制性疾病，建議發病豬隔離治療，發病期間不接種任何疫苗。結合該豬場出現的混合感染情況，可通過投喂黃芪多糖等藥物進行大療程抗病毒或提高免疫力的藥物保健，并建議該豬場針對抗體水平低于80%的豬，及時查找免疫失敗的原因，豬群疾病癥狀好轉后及時對疫苗接種做出調整和補種疫苗；并針對細菌感染種類配合使用1～2療程頭孢類、喹諾酮類的抗生素進行治療。同時，注意環境消毒清潔工作，注意飼養管理，避免出現應激。