新疆某規模化羊場羊支原體肺炎的分子流行病學調查

王紫陽，努爾比亞·艾克木，屈勇剛*，黨瑞瑩，趙 玉，常軍帥，李 巖

（1. 石河子大學動物科技學院，新疆石河子832003；2. 新疆生產建設兵團畜牧獸醫工作總站，新疆烏魯木齊830063）

羊支原體性肺炎（Mycoplasmal pneumoniaof sheep and goats）是由綿羊肺炎支原體（Mycoplasmaovipneumoniae，Mo）、絲狀支原體山羊亞種（M. mycoidessubsp.capricolum，Mmc）、絲 狀 支原體 絲 狀亞種（M.mycoidessubsp.mycoides，Mmm）以及山羊支原體山羊肺炎亞種（M.capricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp）等支原體引起的接觸性傳染病，能夠在綿羊和山羊間廣泛流行，且危害較大。因上述4種常見病原間缺乏交叉免疫保護[1]，故在實施免疫防控策略時必須明確當地主要流行菌株的種型。此外，精氨酸支原體（M.ariginini，Ma）作為條件性致病菌，當動物機體的免疫力下降時可從呼吸道侵入肺部引起肺部病變，也應予以關注。Al-Aubaidi 等[2]于1972 年首次在患有呼吸道疾病的羊中檢出Ma，此后在馬來西亞、尼日利亞、西班牙[3-4]等地均有相關報道。1991 年，王棟等[5]首次從羊病料中分離到Ma，之后該病原在內蒙古、福建、四川等地相繼被檢出[6-8]。

新疆是中國養羊規模最大、出欄量最多的省份之一[9]，養羊業作為新疆的支柱產業獲得了長足的發展。為滿足產業發展需求，近年來不同品種的羊流動頻繁，導致羊支原體性肺炎在一定區域呈流行趨勢。目前，該病已成為影響新疆養羊產業化及可持續化發展的關鍵因素。本研究針對新疆某規?；驁鲩_展了羊支原體感染的分子流行病學調查，以期為該羊場支原體性肺炎的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

隨機采集該場內羊鼻拭子，記錄樣品編號、樣品性質、采樣時間等；對病死羊進行現場剖檢，無菌采取病變組織，記錄編號；對出現胸腔積液的患病羊，采用無菌注射器吸取胸腔積液，裝入無菌EP 管。所有樣品低溫運送至實驗室，-80 ℃保存。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：DNA 快速提取試劑盒（博邁德生物科技有限公司）；2×EsTaq Master Mix、DNA Marker 700（北京全式金生物技術股份有限公司）。

主要儀器：PCR 儀（Bibby 科技有限公司）、電泳儀（上海滬粵明科學儀器有限公司）、UVP 全自動凝膠成像系統（BIO-RAD公司）。

1.3 流行病學調查

選擇新疆某規?；驁觯瑢υ撗驁龅娘曫B數量、品種、免疫情況以及呼吸道疾病的發生情況和發病的季節、癥狀表現、用藥治療、臨床效果等進行調查。

1.4 樣本的處理及DNA的提取

肺臟組織的處理：-80 ℃冰箱取出病變的肺組織樣品，無菌操作臺中使用滅菌的外科剪在病健交界處剪一“+”切口，從切口內取0.5 g組織塊，轉移至1.5 mL離心管；研磨處理后，使用DNA提取試劑盒提取DNA。

鼻拭子樣品接種至KM2液體培養基中，37 ℃培養24 h，12 000 r/min 離心20 min，棄去上清，保留沉淀，PBS緩沖液洗滌兩次后再次收集沉淀，提取基因組；胸腔積液直接采用DNA提取試劑盒提取基因組[10]。

1.5 PCR檢測及測序

參照文獻[11]和[12]，利用根據GenBank上公布的16S rRNA 基因的保守片段序列，分別合成Mo、Mmc、Mmm、Mccp、Ma的特異性引物。引物信息見表1，相關引物由睿博興科有限公司合成。

PCR 反應體系（20 μL）：2×PCR Mix10 μL、滅菌水7 μL、DNA模板2 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL。

PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，退火40 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸35 s，40個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

0.5×TBE 電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖凝膠，取10 μL PCR 擴增的反應產物，加入點樣孔中進行電泳。將有代表性的陽性樣品，切膠回收后測序。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.6 核酸序列分析及進化樹構建

選取部分經PCR擴增為陽性的樣品，對其進行切膠回收送公司測序。測序結果在GenBank 進行核苷酸序列的多重比對，下載相近的序列，使用MEGA7將測序菌株的核苷酸序列與Mo 標準株Y98（Mo Y98）、分離株MoGH3-3株、MYCO22、FJ-SM、Dovre、hyopneumoniae J、PG34、ZaZaFa-1；Ma分離株G230、NBRC、PG6、CBER2012BHK、XJ-KCLLB等進行同源性比較，同時構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 現場流行病學調查結果（見圖1、圖2）

該場飼養羊數量約3 500 只，主要以湖羊、杜泊羊、多浪羊以及雜交羊為主。

由圖1可知，羊群整體處于亞健康的狀態，常年均有咳嗽等臨床表現，發病月份多集中于12 月至第二年3 月；隨著氣溫突變，發病率和病死率呈明顯上升。

該羊場免疫的疫苗主要有羊痘、口蹄疫、三聯四防疫苗等，未免疫過支原體相關疫苗。針對呼吸道疾病常用的藥物包括氟苯尼考、泰妙菌素、慶大霉素、卡那霉素等，但治療效果不佳，僅在用藥期間發病羊群的癥狀有所緩解，但在停藥一段時間后癥狀反復出現。羊群整體表現為間歇性咳嗽，夜間加重，流漿液性鼻涕，患病羊消瘦。

由圖2可知，現場剖檢可見，病理變化多集中于胸腔，常見一側或兩側肺臟呈纖維素性肺炎，肺臟腫大、呈灰紅相間、質地堅硬且缺乏彈性，切面呈大理石狀，胸腔與肺臟存在嚴重粘連，胸腔有纖維性滲出液。

2.2 PCR檢測結果（見圖3～圖5）

本試驗共采集樣品103份（湖羊35份、多浪羊12份、杜泊羊20份、雜交羊36份）。

由圖3、圖4 可知，Mo 樣品1～10 經PCR 擴增、凝膠電泳后，可在凝膠成像系統下出現一條約為433 bp的目的條帶；Ma 樣品1～6 經PCR 擴增、凝膠電泳后，可在凝膠成像系統下出現一條約為545 bp的目的條帶。

由圖5 可知，該規模化羊場Mo 的整體陽性率為43.69%（45/103），其中湖羊、多浪羊、杜泊羊、雜交羊Mo的陽性率分別為54.28%（19/35）、0（0/12）、50.00%（10/20）、41.67%（15/36）。

Ma 的總體陽性率為6.80%，其中湖羊檢出率為8.57%（3/35），杜泊羊檢出率為10.00%（2/20），雜交羊檢出率為5.56%（2/36），多浪羊的檢出率為0（0/12）。

在各品種羊群中均未檢出Mmc、Mmm、Mccp。

2.3 核酸序列分析及進化樹的構建

2.3.1 Mo樣品核酸序列比對結果及進化樹（見圖6、圖7）

由圖6、圖7 可知，經比對Mo 樣品Mo.10 與福建農業科學院從山羊體內的分離株FJ-SM 親緣性最高，樣品Mo.9與中國農業科學院蘭州獸醫研究所分離株MoGH3-3株的親緣性最近，其他測序株單獨成為1個分支。

2.3.2 Ma樣品核酸序列比對結果及進化樹（見圖8、圖9）

由圖8、圖9 可知，Ma 樣品Ma.6 經比對與分離株CBER2012BHK的親緣性最近，與分離株G230也具有一定親緣性，其他測序株單獨成為1個分支。

3 討論

本研究結果表明，該場引起羊傳染性胸膜肺炎的病原主要為Mo 及Ma。儲岳峰等[13]研究報道，Ma 是綿羊和山羊呼吸道疾病常見的病原菌；動物機體免疫力低下或存在其他病原感染時，均可導致肺炎的發生。1992 年，Yechouron 等[14]研究指出，Ma 屬于條件性致病菌，可對免疫力低下的人群造成不同程度的感染，嚴重時可導致死亡；該病原體一般可由動物咬傷或食用動物源性食品而感染，也可經由呼吸道分泌物感染人。南疆地區是肉羊養殖的集中地區，飼養人員與羊群密切接觸，該菌能否通過病畜或間接通過動物產品傳染給人仍有待進一步研究。

PCR 檢測方法是支原體肺炎檢測最為常見的一種方法，其中16S rRNA具有高度的保守性和特異性，目前已成為病原菌檢測一種強力的手段。本試驗對部分PCR 擴增陽性樣品進行測序并構建其親緣進化樹，發現Mo 的感染率高達43.69%，而Ma 的檢出率僅為6.80%。與2019 年杜奕州等[9]、2020 年王雅雯等[15]對南疆部分地區綿羊支原體感染的流行病學調查相比，本調查的結果出現較大的增幅，流行株比對的結果也存在一定的差異。

該羊場支原體的流行情況較為復雜，經在GenBank進行的核苷酸序列比對，樣品Mo.10與福建農業科學院從山羊體內的分離株FJ-SM（Mycoplasma ovipneumoniaestrain FJ-SM.KU870650.1）親緣性最高；樣品Mo.9 與中國農業科學院蘭州獸醫研究所分離株MoGH3-3 株的親緣性最近，其他測序株單獨成為1個分支。樣品Ma.6經比對與南非杜泊綿羊陰道拭子分離株（Mycoplasma argininistrain C1.HQ661823.1）和Ma 分離株（Mycoplasma argininistrain CBER2012BHK clone 4.JQ903581.1）的親緣性最近，與分離株G230（Mycoplasma argininistrain G230.NR_041743.1）也具有一定親緣性。

本調查并未檢出Mmc、Mmm 及Mccp 等病原，表明該場的主要致病菌以Mo為主。在對不同品種進行檢測分析時發現湖羊的感染率最高，而新疆本地品種“多浪羊”并未檢出相關支原體病原，表明該品種羊只對Mo 存在一定抗病性，而湖羊作為從內地引進的品種對Mo 的抗病性方面相對較弱。

4 結論

羊支原體肺炎是能夠在綿羊和山羊間廣泛流行且危害較大的接觸性傳染病。主要以呼吸道傳播為主，危害性大，一旦羊群感染則難以清除，藥物防治效果不佳且極易產生耐藥。該病一旦傳入某個區域，若不采取有效的防控措施，該病將迅速蔓延，防治的方法應采取疫苗免疫、藥物治療、飼養管理等綜合防控措施。