鹿紅方通過調控自噬流對心肌梗死大鼠心功能障礙的影響

趙丹丹， 瞿惠燕， 楊 濤， 張曉青， 周 華

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203)

心肌梗死是世界范圍內發病率和死亡率最高的心臟疾病之一[1]，發病后由于心肌細胞的持續性喪失及適應性的心臟重塑不良，導致心臟功能逐漸惡化，最終可致心力衰竭或死亡[2]。自噬是細胞的一種分解代謝過程，可在營養剝奪、缺氧、生長因子耗竭等應激條件下被激活，其各個階段的協調平衡對及時清除體內受損的蛋白質及細胞器，維持機體內環境和細胞穩態有著重要作用[3-4]。近年來，越來越多證據表明自噬廣泛參與心梗后心室重構的發生發展，并且缺血期間自噬流的受損與心臟的不良重構和持續性的心臟功能障礙密切相關[5-7]。

鹿紅方是上海中醫藥大學附屬曙光醫院周華教授在“心腎同治”的理論基礎上研制而成，具有溫腎強心、活血通絡的功效,在臨床上應用數十年。課題組前期研究表明，鹿紅方可以有效改善心梗后心衰患者的左室射血分數與中醫證候積分，提高患者生活質量，同時可抑制心肌梗死大鼠的心肌纖維化與心肌肥厚，改善心肌細胞的能量代謝等[8-10]。本研究擬復制心肌梗死大鼠模型，同時結合自噬流抑制劑(氯喹)驗證鹿紅方的心臟保護作用與自噬的相關性，并初步探討其可能的作用機制，以期為臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 動物 健康雄性SPF級Wistar大鼠60只，體質量180～200 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2016-0006，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，倫理審查批準號PZSHUTCM200821018。實驗按照動物研究指南——體內實驗報告指南(ARRIVE)進行。

1.2 藥物 鹿紅方(組方藥材鹿角片15 g、紅花9 g、淫羊藿30 g、補骨脂20 g、山萸肉15 g、女貞子30 g、沉香6 g)由上海中醫藥大學附屬曙光醫院中藥房提供，總提取物的制備方法為取各自處方量10倍量的藥材置于不銹鋼鍋中，加水浸泡1 h，先武火煮沸后再文火煎煮1 h，濾過，濾液備用；藥渣按上述方法再煎煮1次，合并濾液，減壓濃縮，噴霧干燥，即得，每1 g約含4.08 g生藥。氯喹(貨號C6628)購自美國Sigma公司。

1.3 試劑 Beclin-1、LC3-Ⅱ、LC3B、P62、GAPDH、HRP標記山羊抗兔IgG抗體(貨號3495、2775、12741、5114、5174、7074)均購自美國Cell Signaling Technology公司；LAMP2、P62抗體(貨號66301-1-lg、66184-1-Ig)均購自美國proteintech公司；HE染液、Masson染液(貨號G1003、G1006)購自武漢賽維爾生物科技有限公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒、RIPA裂解緩沖液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑、 ECL發光顯影液(貨號P0012、P0012AC、P0013C、P1045、P0018AS)均購自上海碧云天生物技術有限公司；LDH測定試劑盒(貨號A020-2)購自南京建成生物工程研究所；CK-MB檢測試劑盒(貨號FSEA3390)購自上海復申生物科技有限公司；異氟烷(貨號S10010533)購自上海玉研科學有限公司。

1.4 儀器 小動物麻醉機、呼吸機(上海玉研科學儀器有限公司，型號ABS-100、SAR-100)；動物用心電圖儀(深圳邦健生物醫療設備股份有限公司，型號ECG-101G)；全自動樣品快速研磨儀(上海凈信實業發展有限公司，型號JXFSTPRP-24L)；酶標儀(美國Bio-Tek公司，型號Synergy H1)；彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司，型號VIVID5)，垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司，型號165-8004)；化學發光成像系統(上海天能科技有限公司，型號4600SF)；透射電子顯微鏡(美國FEI公司，型號Tecnai G2 Spirit BioTWIN)。

2 方法

2.1 建模與分組 60只大鼠隨機分為假手術組、模型組、鹿紅方組、氯喹組、鹿紅方+氯喹組，每組12只。除假手術組外，其余各組大鼠行冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary artery, LAD)結扎術，術前禁食12 h，持續性吸入麻醉，仰臥位固定，氣管插管連接呼吸機，記錄術前Ⅱ導聯心電圖，剃毛、消毒皮膚后于左胸第3～4肋間靠近胸骨處剪開皮膚，鈍性分離肌肉，逐層打開胸腔，去除心包膜，用6～0號帶針線在左心耳下方2～3 mm處結扎LAD，結扎成功后可見結扎區室壁心肌立即變白，心電圖Ⅱ導聯示ST段呈弓背向上抬高。逐層縫合胸腔、肌肉與皮膚，術后每天肌肉注射40萬單位的青霉素預防感染，連續3 d。假手術組在LAD處僅穿線不結扎，其余步驟同前。

2.2 給藥 造模后第2天給藥，按照人與大鼠體表面積法換算給藥劑量，氯喹給藥方法與劑量參照文獻[7,11]報道，鹿紅方組大鼠每天灌胃鹿紅方浸膏2.76 g/kg，氯喹組大鼠每天腹腔注射氯喹50 mg/kg，鹿紅方+氯喹組大鼠每天灌胃鹿紅方浸膏2.76 g/kg+腹腔注射氯喹50 mg/kg，假手術組及模型組大鼠灌胃等容量生理鹽水，每天給藥1次，連續2周。

2.3 超聲心動圖檢測 最后1次給藥結束后，超聲心動圖評估大鼠心臟功能，從短軸視圖中獲取二維圖像，檢測左室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)、左室舒張末期內徑(left ventricular internal dimension diastole, LVIDd)、左室收縮末期內徑(left ventricular internal dimension systole, LVIDs)。

2.4 心肌組織病理學分析 大鼠心肌組織用4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋，切片5 μm，常規脫蠟、覆水，進行蘇木精-伊紅(HE)、馬松(Masson)染色來觀察其病理損傷及纖維化情況，采用Image J軟件分析心肌纖維化的面積。

2.5 心肌損傷標志物檢測 大鼠腹主動脈采血結束后室溫下靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清，檢測血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme, CK-MB)活性。

2.6 透射電鏡觀察心肌細胞超微結構 取距大鼠左心室梗死邊緣2 mm處的心肌，2.5%戊二醛固定至少2 h，然后常規洗滌、固定、包埋，制作超薄切片，醋酸雙氧鈾+檸檬酸鉛雙染色，在透射電子顯微鏡下觀察線粒體、自噬體等超微結構。

2.7 Western blot法檢測心肌組織自噬蛋白的表達 取大鼠左心室梗死邊緣區的心肌組織約50 mg，加入裂解液、磷酸酶和蛋白酶抑制劑，組織研磨機研磨，裂解充分后離心取上清，BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離，濕轉至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，回收一抗，TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，滴加ECL發光液后置于化學發光成像系統中曝光，采用Image J軟件進行定量分析。

2.8 免疫組織化學檢測心肌組織自噬蛋白的表達 取大鼠心肌組織石蠟切片，常規脫蠟至水，檸檬酸鈉進行抗原修復，PBS緩沖液沖洗，加入5%BSA，37 ℃封閉30 min，滴加一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，終止顯色后蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每張片子隨機拍攝3個視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析積分光密度(integrated optical density, IOD)值，其大小與蛋白表達呈正比。

3 結果

3.1 一般情況 假手術組大鼠沒有出現死亡情況，而模型組、鹿紅方組、氯喹組、鹿紅方+氯喹組大鼠分別有3、2、4、3只大鼠死亡。與假手術組比較，模型組、氯喹組、鹿紅方+氯喹組大鼠精神狀態較差，活躍度明顯減退，進食量減少，體質量增加不明顯，后期出現腹水、大便稀溏等癥狀；鹿紅方組大鼠上述情況均明顯改善。

3.2 鹿紅方對心肌梗死大鼠心功能的影響 與假手術組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS降低(P<0.01)，LVIDd、LVIDs升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，鹿紅方組大鼠LVEF、LVFS升高(P<0.05，P<0.01)，LVIDd、LVIDs降低(P<0.05，P<0.01)；與鹿紅方組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠LVEF、LVFS降低(P<0.05，P<0.01)，LVIDs升高(P<0.05)，LVIDd有升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，說明鹿紅方對心臟的保護作用被氯喹所阻斷；與氯喹組比較，鹿紅方+氯喹組LVEF、LVFS、LVIDd、LVIDs無明顯變化(P>0.05)，見圖1。

注：與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與鹿紅方組比較，&P<0.05，&&P<0.01。圖1 各組大鼠心功能Fig.1 Cardiac functions of rats in each group

3.3 鹿紅方對心肌梗死大鼠心肌組織病理形態的影響 假手術組大鼠心肌細胞形態正常，排列整齊，極少量的膠原纖維沉積；與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞變性、壞死，排列紊亂，局部心肌細胞被增生的結締組織取代，大量的膠原纖維沉積，纖維化面積增加(P<0.01)；與模型組比較，鹿紅方組大鼠心肌損傷減輕，細胞壞死、肥大改善，纖維化面積減少(P<0.01)；與鹿紅方組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠心肌損傷加重，細胞大量水腫、壞死，結締組織增生和膠原纖維沉積增多，纖維化面積增大(P<0.01)；與氯喹組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠心肌組織的病理表現類似，纖維化面積無明顯變化(P>0.05)，見圖2～4。

注：標尺為100 μm。圖2 各組大鼠心肌組織HE染色Fig.2 HE staining of myocardial tissues of rats in each group

注：標尺為1 000 μm/100 μm。圖3 各組大鼠心肌組織Masson染色Fig.3 Masson staining of myocardial tissues of rats in each group

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與鹿紅方組比較，&&P<0.01。圖4 各組大鼠心肌纖維化面積Fig.4 Myocardial fibrosis areas of rats in each group

3.4 鹿紅方對心肌梗死大鼠血清LDH、CK-MB活性的影響 LDH、CK-MB正常情況下位于心肌細胞的細胞質中，心肌受損時會釋放入血，常用來評估心肌損傷的嚴重程度[12]。與假手術組比較，模型組大鼠血清LDH、CK-MB活性升高(P<0.01)；與模型組比較，鹿紅方組大鼠血清LDH、CK-MB活性降低(P<0.01)；與鹿紅方組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠血清LDH、CK-MB活性升高(P<0.01)；與氯喹組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠血清LDH、CK-MB活性無明顯變化(P>0.05)，見圖5。

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與鹿紅方組比較，&&P<0.01。圖5 各組大鼠血清LDH、CK-MB活性Fig.5 Activities of serum LDH and CK-MB of rats in each group

3.5 鹿紅方對心肌梗死大鼠心肌組織超微結構的影響 假手術組大鼠肌節及肌絲完整、排列規則，線粒體結構清晰，無破壞、腫脹；模型組大鼠心肌組織萎縮、溶解，肌絲斷裂，肌節破壞，線粒體部分腫脹、結構破壞，胞質中液泡狀的自噬體結構增多；鹿紅方組大鼠心肌損傷減輕，肌節、肌絲排列規整，線粒體腫脹緩解，與模型組比較，胞質中的自噬溶酶體數量增多；氯喹組及鹿紅方+氯喹組大鼠心肌超微結構與模型組相似，液泡狀的自噬體結構增多，見圖6。

3.6 鹿紅方對心肌梗死大鼠心肌組織中自噬蛋白表達的影響 氯喹是常用的自噬流抑制劑，能夠破壞溶酶體的酸性環境，損害溶酶體的功能，同時抑制自噬體與溶酶體的融合，使自噬過程不能完成，故LC3-Ⅱ、P62會積聚。與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達升高(P<0.05，P<0.01)，LAMP2蛋白表達降低(P<0.01)，說明心梗后心肌組織存在溶酶體功能受損，自噬流受阻；與模型組比較，鹿紅方組大鼠心肌組織中Beclin1、LAMP2、LC3-Ⅱ蛋白表達升高(P<0.05)，P62蛋白表達降低(P<0.01)，說明鹿紅方可以改善溶酶體的功能，促進受損心肌的自噬流；與模型組比較，氯喹組大鼠心肌組織中LAMP2蛋白表達降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ、P62蛋白表達升高(P<0.01)，證實了氯喹可以損害溶酶體的功能，阻礙自噬流的通暢；與鹿紅方組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠心肌組織中LAMP2蛋白表達降低(P<0.01)，LC3-Ⅱ、P62蛋白表達升高(P<0.01)，說明氯喹消除了鹿紅方對自噬的調節作用；與氯喹組比較，鹿紅方組+氯喹組大鼠心肌組織中Beclin1蛋白表達升高(P<0.01)，P62蛋白表達降低(P<0.05)，LAMP2、LC3-Ⅱ蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，見圖7。

3.7 鹿紅方對心肌梗死大鼠心肌組織中LC3B、P62表達的影響 LC3B、P62蛋白表達呈陽性時，在細胞質及細胞間質中可見棕黃色顆粒。與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中LC3B、P62光密度值升高(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅方組大鼠心肌組織中LC3B光密度值升高(P<0.05)，P62光密度值降低(P<0.01)，說明鹿紅方可增強心肌梗死大鼠心肌的自噬通量；與模型組比較，氯喹組大鼠心肌組織中LC3B、P62光密度值升高(P<0.01)；與鹿紅方組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠心肌組織中LC3B、P62光密度值升高(P<0.01)；與氯喹組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠心肌組織中LC3B和P62光密度值無明顯變化(P>0.05)，見圖8～9。

4 討論

心肌梗死后的數天至數周，心室重構進程啟動，并進行性出現容量負荷超載、心肌肥厚、心肌細胞死亡等失代償改變，最終導致心功能不斷惡化[13-14]。臨床上，雖然ACEI、ARB及β受體阻滯劑等藥物的廣泛應用可以一定程度穩定或改善心梗后患者的心功能障礙，但心梗后心衰的預后仍不理想，并且長期應用也會導致耐藥性和不良反應增多[15]。目前，越來越多的研究證實中醫藥治療心肌梗死療效確切，且具有毒副作用小的優勢，中西醫結合論治心肌梗死已成為當下研究的熱點與趨勢[16]。

注：A為心肌組織中LC3B免疫組化染色圖，B為LC3B光密度值定量分析統計圖。標尺為100 μm。與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與鹿紅方組比較，&&P<0.01。圖8 各組大鼠心肌組織LC3B免疫組化Fig.8 LC3B immunohistochemistry in myocardial tissues of rats in each group

注：A為心肌組織中P62免疫組化染色圖，B為P62光密度值定量分析統計圖。標尺為100 μm。與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與鹿紅方組比較，&&P<0.01。圖9 各組大鼠心肌組織P62免疫組化Fig.9 P62 immunohistochemistry in myocardial tissues of rats in each group

自噬是機體應對損傷的一個過程，完整的自噬包括自噬前體的形成、自噬體的形成、自噬溶酶體的形成以及自噬溶酶體的降解，這整個發生過程稱為“自噬流”[17]。完整、順暢的自噬過程不僅可以通過三磷酸腺苷循環提供能量，還可以消除受損的蛋白質和細胞器來保護心臟，是心梗后維持正常心臟功能所必需的[18]。有研究表明，在使用海藻糖、雷帕霉素、白藜蘆醇等自噬激動劑促進或恢復受損心肌的自噬流后，限制了心肌缺血時的損傷，減少了慢性缺血重構；而在抑制自噬的表達后，加劇了心梗后的缺血損傷及心功能障礙[19-23]。

在自噬調節的標志物中，Beclin1是啟動自噬的關鍵因子，是自噬小體形成所必須的，其表達量的高低與自噬活性呈正相關[24]。LC3-Ⅱ是自噬小體的標志蛋白，其數量的增加既可能是自噬誘導，也可能是低效的溶酶體降解，要結合自噬流這一整體過程進行評估[25]。P62是一種泛素結合蛋白，當自噬溶酶體形成障礙，自噬降解速率降低時可在胞內累積，其水平與自噬流的強弱呈反相關[26]。此外，一個健康、功能良好的溶酶體系統對于自噬流的整個過程也是至關重要的，而LAMP2正是調節溶酶體功能的關鍵因子，能促進自噬體與溶酶體的融合[27]。本研究結果顯示，鹿紅方可以改善心梗大鼠的心功能，減少心肌纖維化的面積，減輕心肌組織結構損傷，降低血清LDH、CK-MB活性；同時可以提高心梗大鼠心肌組織中Beclin1、LAMP2、LC3-Ⅱ表達，降低P62表達，增加心梗后心肌組織中自噬小體和自噬溶酶體的形成，促進受損心肌的自噬流，但是在與氯喹合用后，鹿紅方的上述調節作用均被阻斷，提示鹿紅方至少部分通過促進心肌細胞的自噬流來改善心梗后的心肌損傷和心功能障礙。

綜上所述，鹿紅方可以通過調節Beclin1/LAMP2介導的途徑，提高自噬小體的形成和促進自噬流的通暢來減輕心肌梗死后的心臟功能障礙，發揮心臟保護作用。然而，調控Beclin1/LAMP2的上游通路眾多，鹿紅方是如何上調Beclin1/LAMP2表達的機制尚不明確，這將是本課題組下一步的研究計劃。