首薈通便膠囊中7種成分測定及其提取工藝優化

馬 云， 韓振明， 馬 健， 張 微， 關永霞， 張貴民

(1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；3.魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276006)

首薈通便膠囊為魯南厚普制藥有限公司研發的中藥6類新藥，現已成功上市[1]，由何首烏、蘆薈、決明子、枸杞子、阿膠、人參、白術、枳實8味中藥組成，以何首烏、蘆薈為君藥，決明子、枸杞子、阿膠為臣藥，人參、白術為佐藥，枳實為使藥，臨床上主要用于功能性便秘的治療[2-3]，尤其對毒邪內蘊、陰液虧虛所致便秘具有良好的潤腸通便作用，并具有排毒養顏、減肥降脂功效，適合老年人、體質虛弱者服用[4]。方中何首烏已分離出一百多種成分，其中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-葡萄糖苷顯示出多種生物活性，如降血糖、抗氧化、抗腫瘤、降脂、抗衰老等[5-8]，可作為該藥材質量評價標志物[9-11]；蘆薈中蘆薈苷、蘆薈大黃素等成分具有通便、抗炎、抗病毒、抗菌、保護肝臟和神經的多重活性[12-13]；決明子、枸杞子、阿膠、人參、白術、枳實所含成分具有調節消化系統[14]、保護胃腸道[15]、降脂[16]、保護心血管[17]、抗癌[18]、免疫調節[19-20]作用，在臨床上達到協同治療、共同起效的效果。

課題組前期對首薈通便膠囊相關物質基礎進行文獻調研，根據其藥理活性及其物質基礎的相關性分析結合指紋圖譜[21]，采用響應面法優化該制劑提取工藝，HPLC法同時測定2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚的含量，以期為全面評價其質量奠定基礎。

1 材料

1.1 試劑 2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(CAS號82373-94-2，純度≥98%)、柚皮苷(CAS號10236-47-2，純度≥98%)、新橙皮苷(CAS號13241-33-3，純度≥98%)、蘆薈苷A(CAS號1415-73-2，純度≥98%)、蘆薈苷B(CAS號28317-16-6，純度≥98%)、蘆薈大黃素(CAS號481-72-1，純度≥97%)、大黃酚(CAS號481-74-3，純度≥98%)對照品均由上海源葉生物科技有限公司提供。乙腈、甲醇為色譜純[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；異丙醇、磷酸為色譜純，甲醇為分析純(南京化學試劑股份有限公司)。

1.2 儀器 Waters高效液相色譜儀[配置Waters e2695四元泵、Waters 2998二極管陣列檢測器、自動進樣器，沃特世科技(上海)有限公司]；LE204E(十萬分之一)、01193-YP601N(萬分之一)電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；數控超聲波清洗器(昆山潔力美超聲儀器有限公司)；純水/超純水系統；有機濾頭(0.22 μm，愛西默科技有限公司)。

1.3 藥物 首薈通便膠囊由魯南厚普制藥有限公司提供，批號200101，生產時間為2020年1月。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 取本品內容物適量，研細，精密稱取0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲(250 W、100 Hz)處理60 min，放冷至室溫，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，吸取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液 精密稱取2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚對照品適量，50%甲醇溶解并制成質量濃度分別為0.767 0、1.865、1.139、0.801 0、2.936 5、0.176 0、0.088 0 mg/mL的貯備液，取適量，稀釋成每1 mL分別含七者0.076 7、0.186 5、0.113 9、0.080 1、0.587 3、0.017 6、0.008 8 mg的溶液，即得。

2.2 色譜條件 Agilent ZORBAX XDB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm；進樣量5 μL；理論塔板數按2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷計，不得低于5 000。HPLC色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 吸取“2.1.2”項下對照品溶液適量，在“2.2”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

1.2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 2. 柚皮苷 3. 新橙皮苷 4. 蘆薈苷A 5. 蘆薈苷B 6. 蘆薈大黃素 7. 大黃酚圖1 各成分HPLC色譜圖

表2 各成分線性關系

2.3.2 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照品溶液適量，在“2.2”項色譜條件下進樣測定6次，測得2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為1.41%、1.32%、1.32%、2.22%、0.74%、2.16%、1.35%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取本品(批號200101)內容物粉末6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚含量RSD分別為1.66%、0.67%、1.42%、1.94%、0.58%、1.86%、1.89%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 精密稱取本品(批號200101)內容物粉末適量，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24、48 h在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為1.54%、1.08%、1.44%、1.43%、0.96%、1.82%、1.57%，表明溶液在48 h內穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的本品內容物粉末6份，精密加入對照品溶液，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚平均加樣回收率分別為100.35%、98.81%、97.22%、98.40%、97.95%、98.95%、101.39%，RSD分別為1.99%、2.08%、1.30%、1.61%、0.46%、1.64%、1.90%。

2.4 提取工藝優化 采用Design-expert 8.0軟件，設計3因素5水平響應面模型，選擇甲醇體積分數(X1)、提取時間(X2)、料液比(X3)作為影響因素，各成分總峰面積(Y)作為評價指標，中心組合設計運行20次，設定顯著性測試置信水平為95.0%(即P<0.05)，重復3次，因素水平見表3，結果見表4。

表3 因素水平

表4 試驗設計與結果(n=3)

表5 方差分析

響應面分析見圖2。由圖2A可知，當提取時間一定時，隨著甲醇體積分數增加，各成分總峰面積升高，但超過50%時開始降低；當甲醇體積分數一定時，隨著提取時間延長各成分總峰面積變化不明顯。由圖2B可知，當料液比一定時，隨著甲醇體積分數增加各成分總峰面積升高，在50%左右出現最高值，之后開始降低；當甲醇體積分數一定時，隨著料液比增加各成分總峰面積升高，在1∶100左右出現最高值，之后基本穩定。由圖2C可知，當提取時間一定時，隨著料液比增加各成分總峰面積升高；當料液比一定時，隨著提取時間延長各成分總峰面積升高程度緩慢。

注：左圖為三維曲面圖，右圖為等高線圖。圖2 各因素響應面圖

采用Design-expert 11.0軟件進行分析，并結合實際操作情況，確定最優提取工藝為甲醇體積分數50%，提取時間60 min，料液比1∶100。再進行3批驗證試驗，測得各成分總峰面積為37 345 513，與預測值比較相對誤差僅為0.47%，表明該工藝切實可行。

3 討論

3.1 色譜條件篩選 蘆薈苷A、蘆薈苷B是同分異構體，兩者可相互轉化，并在一定條件下氧化分解，生成蘆薈大黃素及其他成分[22]，前期報道中它們是統一按照蘆薈苷進行含量計算[1]，但由于方法的不穩定性，經常存在肩峰或分叉峰情況，對色譜圖積分的準確度造成影響。因此，本實驗更改流動相有機相比例、pH值、洗脫梯度，發現在“2.2”項色譜條件下蘆薈苷A、蘆薈苷B分離度最好。

3.2 檢測波長篩選 本實驗對各成分進行全波長掃描，最終確定為220 nm。

3.3 柱溫篩選 本實驗考察了柱溫25、30、35 ℃，發現在30 ℃下各成分色譜峰分離度理想，出峰時間適當。

4 結論

本實驗建立HPLC法同時測定首薈通便膠囊中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚的含量，并采用響應面法優化該制劑提取工藝，對提升其質量標準、推動相關規范化生產具有重要意義。