二十五味肺病丸對博來霉素致肺纖維化小鼠的作用

張 弓， 賈 莉， 高亞豐*

(1.延安大學附屬醫院臨床藥物科，陜西 延安 716000；2.延安市人民醫院呼吸科，陜西 延安 716000)

肺纖維化是一種間質性肺病，表現為肌成纖維細胞過度增殖活化和細胞外膠原蛋白異常聚積于肺組織，是肺組織持續損傷后的異常修復結果，也是多種肺病發展至晚期的必經過程，患者最終因呼吸衰竭而死亡，被診斷出該病的患者存活時間為3～5年[1]。該病的發病機制尚不清楚，多種因素可引發肺纖維化，相應的診斷方法也受到限制，因此，一經發現，多數患者已至晚期[2]。截止到目前，國際上僅有比菲尼酮和尼達尼布作為延緩肺纖維化發病進程的藥物，但是這2款藥物伴隨有嚴重的副作用(如光敏感、肝功損害等)[3]。因此開發新的治療肺纖維化的藥物對于改善患者生活質量和延長存活時間具有重大的實際意義。

二十五味肺病丸始載于《四部醫典》，是依據傳統藏醫藥理論，結合現代制藥工藝研制而成的治療肺部疾病的新型藏藥，由檀香、紅花、獐牙菜、肉果草、甘肅蚤綴、鐵棒錘(根、葉)等25味藥材組成，適用各種肺病引起的咳嗽、胸脅痛、發燒、呼吸急促、咳帶膿血、盜汗等，對陳舊性肺結核、慢性肺炎、肺氣腫、間質性肺炎等熱性肺病的療效明顯[4-5]。目前尚無關于二十五味肺病丸治療肺纖維化的報道，因此，本研究在其傳統用藥特點基礎上，探究其對肺纖維化的治療作用，為其進一步臨床應用提供實驗數據。

1 材料

1.1 動物 清潔級C57BL/6小鼠50只(雌雄各半)，6～8周齡，體質量20～25 g，由甘肅中醫藥大學科研實驗中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(甘)2011-0002。

1.2 儀器 DxH800型血液分析儀[貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司]；YKY-1000型尼康熒光顯微鏡(上海永科光學儀器有限公司)；CM1520型冰凍切片機(德國徠卡公司)；Western blot顯影儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 試劑 HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒、TNF-α檢測試劑盒、DAPI、二抗、BCA試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；山羊抗小鼠TGF-β1、α-SMA、TNF-α、NF-κB、p-Smad2、Smad2、Col-Ⅰα、β-actin抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)。

1.4 藥物 二十五味肺病丸(批號2014110102)購自西藏雄巴拉曲神水藏藥廠。比菲尼酮粉末(貨號Y0001769)購自美國Sigma-Aldrich公司；博來霉素(粉劑，規格100 mg，批號415A025)購自日本化藥株式會社。

2 方法

2.1 藥物配制 二十五味肺病丸采用冷凍干燥后于低溫下研磨成粉末，準確稱取150 mg二十五味肺病丸粉末，溶于10 mL 0.9%氯化鈉溶液中制成混懸液備用；準確稱取50 mg比菲尼酮粉末，溶于10 mL 0.9%氯化鈉溶液中制成陽性藥混懸液備用；博來霉素用0.9%氯化鈉溶液配成5 mg/kg藥液備用。

2.2 動物分組及給藥 小鼠正常飲食、飲水適應性飼養1周后，按體質量隨機分為空白組、模型組、陽性藥組和低、高劑量二十五味肺病丸組，每組10只。所有小鼠用10%水合氯醛麻醉固定后，參考Szapiel法[6]，采用氣管內滴注博來霉素的方法建立肺纖維化模型，即沿頸正中切開1 cm，鈍性分離至氣管，用注射器向氣管內注射博來霉素(5 mg/kg)，縫合切口；空白組進行同樣手術操作，氣管內注射等容量0.9%氯化鈉溶液，造模24 h后灌胃給藥，按照人和小鼠用藥劑量換算，二十五味肺病丸低、高給藥劑量分別為300、450 mg/kg，陽性藥組給藥劑量為100 mg/kg，空白組及模型組給予等容量0.9%氯化鈉溶液，每天給藥1次，連續15 d。實驗終點時，各組小鼠用10%水合氯醛麻醉，摘眼球取血；脫頸處死各組小鼠，收集肺泡灌洗液；摘取肺組織備用。

2.3 指標檢測

2.3.1 肺泡灌注液中白細胞數量的檢測 剖胸并將穿刺針頭插入氣管、結扎肺氣管，往肺氣管注入0.3 mL 0.9%氯化鈉溶液，抽吸混勻，重復4次，收集肺泡灌洗液1.0 mL，在4 ℃條件下，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，取細胞重懸后進行白細胞計數分析。

2.3.2 ELISA法檢測血清TNF-α水平 摘眼球采血，室溫下靜置2 h，在4 ℃條件下，1 500 r/min離心20 min，取血清備用，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清TNF-α水平。

2.3.3 免疫熒光染色檢測TGF-β1、α-SMA表達 肺組織稱定質量后，取部分固定于4%多聚甲醛，取其中一小葉包埋于OCT中，于-20 ℃條件下預凍10 min，然后轉移至冷凍切片機冷凍臺上(-40 ℃)冷凍10 min，切片4 μm厚，進行免疫熒光染色。切片分別加入TGF-β1、α-SMA一抗(1∶50)后，4 ℃孵育過夜，TBST洗片4次，每次10 min，室溫孵育FITC標記的二抗(1∶200)2 h，DAPI染色3 min，TBST洗片4次，每次10 min，然后經過梯度乙醇脫水后二甲苯透明，封片后鏡檢。

2.3.4 Western blot法檢測肺組織炎癥和纖維化信號通路中的蛋白表達 取少量肺組織，用RIPA裂解液進行裂解勻漿，4 ℃條件下離心10 min，取上清液即為總蛋白，用BCA法進行濃度檢測。取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，濕法轉于PVDF膜上，室溫下用5%牛血清白蛋白封閉2 h，一抗孵育過夜(1∶1 000)，然后二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h后，采用Bio-Rad多功能成像系統曝光并拍照，采用Image J分析軟件對目的蛋白條帶進行灰度值分析。

3 結果

3.1 二十五味肺病丸對肺纖維化小鼠組織結構及TNF-α水平的影響 如圖1A～1B所示，空白組小鼠肺組織呈正常網狀規則分布，無炎癥細胞浸潤和間質增生，幾乎無膠原沉積；模型組小鼠肺組織肺泡塌陷嚴重，肺間質有大量炎癥細胞的浸潤，出現明顯的間質增生，肺泡結構紊亂，破壞增多，較多呈片狀分布的瘢痕條索，淋巴細胞浸潤較多，部分毛細血管可見閉塞，有大量的藍染膠原沉積；高劑量二十五味肺病丸可以明顯改善博來霉素造成的肺組織纖維化，使得肺組織病變結構有所改善，減少膠原沉積，但是低劑量無明顯改善作用。 如圖1C～1D所示，與空白組比較，模型組小鼠肺系數及TNF-α水平升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組和高劑量二十五味肺病丸組小鼠肺系數及TNF-α水平均降低(P<0.05，P<0.01),低劑量二十五味肺病丸組無明顯變化(P>0.05)。

3.2 二十五味肺病丸對肺纖維化小鼠支氣管灌注液中白細胞數量的影響 如表1所示，與空白組比較，模型組小鼠肺泡灌注液中總白細胞數量增多(P<0.01)，其中中性粒細胞占比增加(P<0.01)，巨噬細胞占比減少(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組和高劑量二十五味肺病組小鼠肺泡灌注液總白細胞數量減少(P<0.01)，其中中性粒細胞占比減少(P<0.01)，巨噬細胞占比增加(P<0.01)。

表1 二十五味肺病丸對小鼠肺支氣管灌注液中白細胞數量的影響

3.3 二十五味肺病丸對肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1表達的影響 如圖2所示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織中TGF-β1表達升高(P<0.01)；與模型組比較，高劑量二十五味肺病丸和比菲尼酮均可抑制肺組織中TGF-β1的表達(P<0.05，P<0.01)。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 各組小鼠肺組織中TGF-β1表達

3.4 二十五味肺病丸對肺纖維化小鼠肺組織α-SMA表達的影響 如圖3所示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織中α-SMA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，高劑量二十五味肺病丸和比菲尼酮均可抑制肺組織中α-SMA的表達(P<0.05)。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。圖3 各組小鼠肺組織中α-SMA表達

3.5 二十五味肺病丸對肺纖維化小鼠肺組織中NF-κB、TNF-α和TGF-β1蛋白表達的影響 如圖4所示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織中NF-κB、炎癥因子TNF-α和纖維化因子TGF-β1蛋白表達均升高(P<0.01)；與模型組比較，高劑量二十五味肺病丸和比菲尼酮均可抑制NF-κB、TNF-α、TGF-β1蛋白表達(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，低劑量二十五味肺病丸對NF-κB、TNF-α蛋白表達無明顯的抑制作用(P>0.05)，但是卻對TGF-β1蛋白表達有抑制作用(P<0.05)，說明低劑量二十五味肺病丸可能通過其他通路抑制TGF-β1的表達。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 各組小鼠肺組織中NF-κB、TNF-α和TGF-β1的蛋白表達

3.6 二十五味肺病丸對肺纖維化小鼠TGF-β1/Smad信號通路的影響 如圖5所示，與空白組小鼠比較，模型組小鼠肺組織中p-Smad2、Col-Ⅰα、α-SMA蛋白表達均升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組和高劑量二十五味肺病丸組均可p-Smad2、Col-Ⅰα、α-SMA蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)，低劑量二十五味肺病丸組TGF-β1/Smad信號通路相關蛋白無明顯變化(P>0.05)。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 各組小鼠p-Smad2、Col-Ⅰα、α-SMA蛋白表達

4 討論

肺纖維化發病機制較為復雜，詳細機制仍不清楚，根據肺纖維化發病過程可知肺泡上皮細胞受到損傷后會引發凋亡，而凋亡的細胞會被吞噬細胞吞噬和溶解，溶解物的外泄會促使局部產生炎癥反應，而反復的上皮細胞損傷會誘導持續的炎癥進而引發纖維化，所以，炎癥和纖維化是引起肺纖維化的兩個重要階段[2,7]。炎癥階段主要以炎癥細胞(主要為中性粒細胞)浸潤肺泡和肺間質為主要特點，炎癥細胞的浸潤促使機體清除凋亡的肺泡上皮細胞，同時形成炎癥微環境，導致肺上皮細胞和肺成纖維細胞產生并分泌大量炎癥細胞因子從而進一步加強炎癥反應和引起纖維化。眾多炎癥因子中，TNF-α可直接引發肺纖維化，TNF-α主要由中性粒細胞產生，本實驗中，模型組小鼠中性粒細胞數量急劇增多，說明產生炎癥反應，而模型組小鼠TNF-α的高表達進一步證明肺纖維化過程中嚴重的炎癥反應，二十五味肺病丸可減少總的白細胞數量，其中以降低中性粒細胞為主，并且降低TNF-α水平，說明該藥物具有抑制炎癥的作用。NF-κB信號通路是引發炎癥的關鍵信號通路，本實驗結果表明二十五味肺病丸可通過抑制NF-κB的表達進而達到抑制炎癥的作用。此外，TNF-α可以直接促進肌成纖維細胞的大量增殖而引發肺纖維化，因此，開發TNF-α特異性抑制劑成為治療肺纖維化的一大研究熱點[8-9]。本實驗研究結果表明，二十五味肺病丸不僅可以通過抑制NF-κB信號通路降低炎癥反應而發揮抗肺纖維化的作用，更有可能作為TNF-α的抑制劑來抑制肌成纖維細胞的大量增殖實現肺纖維化的逆轉功效。

研究表明TGF-β1是引發肺纖維化的關鍵因子，在肺纖維化過程中起到銜接炎癥和纖維化的橋梁作用，本實驗結果表明，二十五味肺病丸可以通過抑制NF-κB信號通路來減少TGF-β1的過表達，從而達到抑制肺纖維化的作用。TGF-β1可與其特異性胞外受體結合，激活細胞內TGF-β1/Smads信號通路，進而啟動細胞核內相關基因轉錄、翻譯并表達胞外間質蛋白，從而引發肺纖維化。此外，TGF-β1/Smads信號通路的激活可誘導肺泡上皮細胞和肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，進一步加重肺纖維化的產生[10-11]。所以，有效地抑制TGF-β1/Smads通路是治療肺纖維化過程中纖維化階段的潛在作用靶點。本實驗結果表明，二十五味肺病丸可以抑制肺纖維化小鼠Col-Ⅰα和α-SMA的表達，其作用機制是通過特異性抑制TGF-β1/Smads信號通路中的p-Smad2而得以實現逆轉肺纖維化。α-SMA是肌成纖維細胞的特異性表達蛋白，二十五味肺病丸可抑制該蛋白的表達，一方面說明二十五味肺病丸具有治療肺纖維化的作用，另外也提示該藥可能對肺纖維化過程中肺泡上皮細胞和肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化具有抑制作用。