基于GC-MS和網絡藥理學研究七味廣棗散揮發油防治心血管疾病的成分及機制

李書迪， 齊和日瑪， 于景華， 郭慧卿， 王鑫晶， 成日青*

(1.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110；2.內蒙古醫科大學第一附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010059)

隨著人們生活習慣及飲食結構的改變，心血管疾病在我國的發病率及死亡率逐年上升。據《中國心血管病報告2018》統計，我國心血管疾病死亡率居城鄉居民死亡原因首位，占死亡構成的40%以上，已成為當今社會人群健康所面臨的重要公共衛生問題[1]。

七味廣棗散為臨床常用的蒙古族驗方，由廣棗、丁香、肉豆蔻、沉香、木香、楓香脂、牦牛心7味藥材組成，具有養心益氣，安神之功效，用于防治胸悶疼痛、心悸氣短、心神不安、失眠健忘等癥。方中丁香、沉香、肉豆蔻、木香、楓香脂均富含揮發油成分，易透過血腦屏障，具有藥理活性豐富、起效靶點多、不良反應較少等特點[2]，該類成分除了具有抗炎、抑菌、抗病毒活性外，還具有保護血管內皮、抗氧化、改善心肌功能、調節心血管活性等多種對心血管有益的作用[3-7]。蒙醫藥在防治心血管疾病方面具有一定特色優勢，有多種臨床常用、效果顯著的傳統方劑，如三味檀香散、肉豆蔻五味丸、阿敏·額爾敦、八味沉香散等，其組成均含揮發性藥味，如肉豆蔻、沉香、木香、丁香等，表明在抗心血管疾病類蒙藥處方中揮發油可能是一類重要的有效成分，但目前相關研究較少。因此，本研究通過GC-MS對七味廣棗散揮發油進行成分分析，并借助網絡藥理學篩選出防治心血管疾病的主要活性成分、關鍵靶點及潛在信號通路，從系統生物學角度探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 儀器 Trace DSQⅡ GC-MS儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；ZTB-A磁力加熱攪拌電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；800Y型多功能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司)；10 mL揮發油提取器(安徽省天長市東亞玻璃儀器廠)。

1.2 藥材與試劑 廣棗(產地廣東，批號C17082902)、丁香(產地廣西，批號193090101)、木香(產地云南，批號1811001)、沉香(產地海南，批號181411001)、肉豆蔻(產地廣西，批號190920201)、牦牛心(產地西藏，批號170701)、楓香脂(產地福建，批號1811010589)均購自內蒙古天康蒙中醫藥有限責任公司，經內蒙古醫科大學渠弼教授鑒定為正品。乙酸乙酯為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1 揮發油提取 參照2015年版《中國藥典》四部通則中“2204揮發油測定法”項下“甲法”操作，稱取七味廣棗散120 g，加5倍量水回流提取6 h，得黃色澄明液體，即為揮發油。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 GC條件 TR-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫(初始溫度50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至280 ℃，保持3 min)；進樣口溫度250 ℃；檢測器FID，溫度240 ℃；載氣氮氣，純度99.99%，體積流量1.0 mL/min；分流比50∶1；氫氣體積流量20 mL/min；空氣體積流量400 mL/min；進樣量2 μL。

2.2.2 MS條件 EI電離；離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；電子轟擊能量70 eV；溶劑延遲3 min；掃描范圍m/z50～650。

2.2.3 揮發油成分分析 取“2.1”項下揮發油適量，乙酸乙酯溶解后在“2.2”項條件下進樣測定，質譜數據經NIST 2.0質譜數據庫檢索匹配后再與文獻[8-11]報道比對，確定各化學成分。

2.3 網絡藥理學研究

2.3.1 成分數據收集 以“2.2.3”項下鑒定出的成分為研究對象，在Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中以成分的CAS號為檢索詞，得到其分子結構，并保存為Canonical SMILES格式。

2.3.2 成分靶點獲取 將“2.3.1”項下SMILES格式文件導入SwissTargetPrediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)、SuperPred 數據庫(http://prediction.charite.de/)中，選定研究物種為“Homosapiens”，得到成分的對應靶點，保存數據，整合、去重后得到化合物的潛在作用靶點。

2.3.3 疾病靶點獲取 使用DisGeNET 數據庫(https://www.disgenet.org/)，以心血管相關疾病為關鍵詞進行檢索，獲得作用靶點，將其導入Excel表格中，整合、去重后得到疾病的潛在作用靶點。

2.3.4 潛在作用靶點獲取 將化合物、疾病的靶點錄入Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線作圖工具平臺上，繪制韋恩圖，得到兩者交集(即共同靶標)，作為潛在作用靶點。

2.3.5 網絡模型構建及分析 將“2.3.4”項下潛在作用靶點及其對應成分分別導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建“化學成分-作用靶點”網絡，使用 Network Analyzer功能對網絡進行分析，根據節點Degree、Betweenness、Closeness篩選出七味廣棗散揮發油防治心血管疾病的主要活性成分。

2.3.6 PPI網絡構建及分析 將“2.3.4”項下篩選得到的交集靶點輸入STRING數據庫(https://string-db.org/)中，構建蛋白相互作用網絡模型，選擇物種為“Homosapiens”，設定最低相互作用閥值為“Highest confidence(0.9)”，其余參數保持默認設置，獲得蛋白相互作用信息，保留文件中的節點信息(node1、node2)并將其導入 Cytoscape 3.6.0軟件，構建PPI網絡并進行拓撲指標分析，篩選出關鍵靶點。

2.3.7 富集分析 將篩選得到的關鍵靶點輸入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)中，進行GO富集分析(包括生物過程、細胞組分、分子功能)和KEGG信號通路分析。

2.3.8 分子對接 通過PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)下載靶蛋白的3D結構并保存為PDB格式，通過Pubchem數據庫下載成分的3D結構并保存為SDF格式，將準備好的靶蛋白和化合物分子結構導入Discovery Studio軟件，進行分子結構常規預處理，再選擇Libdock模塊進行分子對接，分析其結合活性。

3 結果

3.1 揮發油成分鑒定 揮發油總離子流圖見圖1，通過質譜數據庫檢索及文獻比對，共鑒定出35種成分，其中丁香酚含量最高，占總量的42.83%，其次是肉豆蔻醚，占總量的7.06%，見表1。

圖1 揮發油GC-MS總離子流圖

3.2 潛在靶點收集 將 Swiss、SuperPred數據庫中得到的預測靶點去重后，共得到成分靶點341個，通過DisGeNET數據庫得到疾病靶點2 943個，在Venny 2.1.0在線作圖工具平臺上輸入成分、疾病的靶點，繪制韋恩圖(圖2)，兩者取交集后得共同靶點188個。

圖2 成分、疾病靶點的韋恩圖

3.3 化學成分-作用靶點網絡構建及分析 將化學成分及188個潛在作用靶點導入Cytoscape軟件，繪制網絡圖(圖3)，并通過Network Analyzer 對網絡圖進行分析。結果顯示，丁香酚、黃樟醚、桉葉素、α-細辛醚、異丁香酚、α-松油醇、甲基丁香酚、杜松醇、肉豆蔻醚均能與25個以上靶點相連接，可能在防治心血管疾病過程中發揮重要作用，同時3-側柏烯、桉葉素、3-蒈烯、檀香醇、黃樟醚、杜松醇、丁香酚、甲基丁香酚、α-松油醇、苯甲醛又可共同作用于靶點ACHE，體現了揮發油多成分、多靶點的綜合調節特點。

表1 揮發油成分分析結果

圖3 化學成分-作用靶點相互作用網絡圖

3.4 PPI網絡構建 在STRING數據庫中錄入188個潛在作用靶點，得到蛋白相互作用信息，使用Cytoscape軟件對上述數據進行可視化分析，構建PPI網絡，并對網絡進行篩選，計算度值(Degree)、中介中心性(Betweeness)、接近中心性(Closeness)的中位數，以高于3者為標準，篩選出47個關鍵靶點，見表2，其中度值最高的為APP，能與35個蛋白發生相互作用，其次是PIK3CA、MAPK1、STAT3、SRC，分別能與29、28、27、27個蛋白發生相互作用。PPI網絡圖見圖4，節點越大，顏色越深，靶點度值越高；顏色越淺，節點越小，代表度值越低。

圖4 PPI網絡圖

表2 關鍵靶點信息

3.5 靶點通路分析 將47個關鍵靶點通過DAVID數據庫進行GO功能富集分析，得到139個條目(P<0.001)，包括91個生物學過程(排名前20條目繪制柱狀圖，圖5A)、14個細胞組分(圖5B)、34個分子功能(排名前20條目繪制柱狀圖，圖5C)，提示生物過程(BP)顯著富集在RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、血小板活化、NO生物合成、凋亡過程的調控、細胞增殖的調控等；細胞組分(CC)主要涉及核染色質、核漿等；分子功能(MF)主要集中在轉錄因子結合、酶結合、激酶活性、蛋白質磷酸酶結合等。

圖5 GO功能富集分析

利用DAVID數據庫對交集靶點進行KEGG通路分析，以P<0.001為條件，共篩選出67條信號通路，應用Omicshare (http://www.omicshare.com/) 對前20條通路富集分析結果作氣泡圖，結果見圖6。由此可知，靶點數排名靠前的為胰腺癌通路(pancreatic cancer)、甲狀腺激素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、催乳素信號通路(prolactin signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、前列腺癌(prostate cancer)、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)等，表明揮發油可通過作用于不同的通路來防治心血管疾病。

圖6 KEGG通路富集分析

3.6 分子對接驗證 選擇PPI網絡中度值排名前五的關鍵靶點與其對應的活性成分進行分子對接，結果見表3，得分越高，分子與受體結合越好。由此可知，APP與α-細辛醚、異丁香酚結合的可能性相對較高，PIK3CA與甲基丁香酚，SRC與丁香酚、異丁香酚的結合效果也相對較好。APP與α-細辛醚、SRC與丁香酚的分子對接模式見圖7。

表3 分子對接結果

圖7 APP與α-細辛醚、SRC與丁香酚分子對接模式圖(A、B)和細節2D展示圖(a、b)

4 討論

本研究通過對“化學成分-作用靶點”網絡進行拓撲學分析，篩選出9種關鍵成分。其中，丁香酚在揮發油測定結果中峰面積占比最大，同時在拓撲學分析中Degree值最高。現代藥理學研究表明，丁香酚除具有抑菌、抗炎、抗氧化、麻醉等藥理作用外，在心血管方面還表現出降壓、抗心律失常和保護心肌細胞等作用[12-13]。研究發現，丁香酚能提高Na2S2O4造成的缺氧/復氧損傷心肌細胞的存活率[14]，對H2O2誘導H9c2心肌細胞損傷也具有保護作用[15]。

通過Cytoscape對潛在作用靶點得到的蛋白互作信息進行拓撲學分析，篩選出關鍵靶點47個，靶點間通過769條相互作用協同影響疾病的防治。關鍵靶點和活性成分的對接結果顯示，除MAPK1與桉葉素、STAT3與異丁香酚結合效果不佳外，其余成分與靶點間均有較好的結合能力。

GO分析富集結果顯示，47個關鍵靶點主要分布在139個GO功能過程，其中包括91個生物過程，如轉錄的調節、血小板活化、NO生物合成、凋亡過程的調控、細胞增殖、細胞遷移等。這些生物過程貫穿于藥物治療疾病的整個作用機制中，表明七味廣棗散揮發油可通過調控多個生物學過程來發揮防治心血管疾病的作用。

KEGG富集結果表明，關鍵靶點主要富集于胰腺癌、甲狀腺激素、HIF-1等67條信號通路。其中，HIF-1信號通路、VEGF信號通路、cAMP信號通路在心血管疾病的防治過程中起重要作用。VEGF是目前所發現的唯一特異性地促進血管內皮細胞有絲分裂的生長因子，具有促進血管新生和增加血管通透性等多種功能，通過降低或抑制VEGF的表達，可以減少血管新生，防治動脈粥樣硬化的發生發展[16]。心肌缺血及缺氧時，缺氧區域三磷酸腺苷(ATP)生成障礙，而在缺氧條件下缺氧誘導因子-1(HIF-1)穩定表達，可參與調控醛縮酶和丙酮酸激酶等改善能量代謝，調控缺氧適應，也可誘導VEGF轉錄和表達從而促進血管新生，并影響炎癥發生等多種途徑[17-18]。cAMP是一種環狀核苷酸，可以使蛋白激酶A(PKA)激活，還使cAMP底物蛋白磷酸化，加速對鈣的攝取和轉運[19]，從而調節鈣穩態，心肌收縮，細胞命運和基因轉錄等。

綜上所述，本研究借助GC-MS技術和網絡藥理學方法，初步探討了七味廣棗散揮發油防治心血管疾病的活性成分及可能作用機制，為后續進一步的實驗研究提供了思路及理論依據。