高脂肪酶活性菌株的選育及其發酵制備豆豉中磷脂類物質含量的變化

孫家正，王偉明，鄭宏宇，孫銀玲，丁純潔，陳麗艷

(黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱，150036)

豆豉為我國傳統大豆發酵食品，具有調節血脂、改善心血管功能、降低血糖、抗骨質疏松、抗腫瘤等作用[1-2]。大豆在發酵過程中經多種微生物酶的作用，一些成分發生了生物轉化，其中報道較多的如大豆異黃酮苷轉化為苷元、大豆蛋白轉化為小分子肽或氨基酸[3-4]，而磷脂類成分的變化鮮見報道。磷脂是組成人體細胞的主要成分,對肝病、高血壓、阿爾茲海默癥等疾病的防治有一定的效果[5-7]。大豆磷脂是植物型磷脂的主要來源，是多元醇與脂肪酸及其衍生物酯化而形成的弱極性化合物，根據堿基不同分為磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)等。功能性磷脂的合成常采用脂肪酶作為催化劑實現富含特殊功能脂肪酸為底物的酰基供體與磷脂的酯交換反應[8-9]。本研究首次結合常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)誘變育種技術[10-11]選育高脂肪酶活性的優良菌株，考察其發酵制備豆豉過程中PC、PI和PE功能性成分的含量變化，確定富含功能性磷脂的豆豉制備工藝，提高豆豉的應用價值。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

淡豆豉飲片，北京同仁堂哈爾濱藥店；黑豆，黑龍江和糧農業有限公司。

PC對照品(純度≥ 99%)，Sigma; PI對照品(純度50%); PE對照品(純度≥ 99%),Aladdin。

維多利亞藍B, Aladdin;中性紅染色劑, Solarbio;馬鈴薯葡萄糖水培養基、大豆蛋白胨,青島海博生物技術有限公司;酵母膏, 北京奧博星生物技術有限公司;正己烷、異丙醇，均為色譜級，Simark；冰乙酸(色譜級)，天津科密歐化學試劑有限公司；三乙胺(色譜級)， 福晨(天津)化學試劑有限公司；對硝基苯酚棕櫚酸，Sigma。其他試劑均為分析純。

1.2 培養基

富集培養基(g/L)：大豆蛋白胨10、葡萄糖15、酵母膏5、NaCl 2.5。

中性紅油脂平板(g/L)：大豆蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 5、MgSO40.5、瓊脂20、橄欖油聚乙烯醇乳化液120 mL、16 g/L中性紅溶液1 mL，pH 7.0～7.5。

維多利亞藍油脂平板(g/L)：大豆蛋白胨10、NaCl 2.5、(NH4)2SO42、K2HPO41、MgSO40.5、瓊脂20、維多利亞藍B 0.04，橄欖油聚乙烯醇乳化液120 mL。

發酵培養基(g/L)：大豆蛋白胨10 g、NaCl 0.5、(NH4)2SO42、K2HPO41、MgSO40.5、酵母粉5，橄欖油聚乙烯醇乳化液120 mL，pH為7.0～7.5。

1.3 儀器與設備

LM17R冷凍高速離心機，美國賽默飛世爾公司；Biolog自動微生物鑒定系統，美國Biolog公司；ARTP-M誘變育種儀，清華無錫天木生物科技有限公司；XSR205DU電子天平、S40型pH計，瑞士METTLER TOLEDO公司；BSA2245電子天平，德國賽多利斯集團；DL-CJ-2N潔凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；HNY-202B搖床培養箱，江蘇中和實驗儀器制造有限公司；LDZM-60KC高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；DHP-9272恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；LC-2030C3D高效液相色譜儀、ELSD-LTⅡ蒸發光檢測器，日本島津制作所；CX31光學顯微鏡，日本OLYMPUS公司；UV-5200紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 高脂肪酶活性菌株的選育

1.4.1.1 出發菌株篩選

初篩采用中性紅油脂平板與維多利亞藍平板相結合的方法[12]。將淡豆豉飲片粉碎，過二號篩，精密稱取1 g溶于10 mL滅菌的蒸餾水中，充分攪拌溶解，靜置，吸取上層溶液1 mL置入裝有100 mL富集培養基的三角瓶中，于30 ℃、180 r/min搖床培養3 d，梯度稀釋至10-4、10-5、10-6，分別吸取100 μL涂布于中性紅油脂平板，于30 ℃培養3 d，挑取紅色變色圈或透明圈的菌落再轉接到維多利亞藍平板培養基中，于30 ℃繼續培養3 d，挑選有深藍色水解圈或透明圈的菌落，作為初篩目的菌株。

將初篩目的菌株轉接入馬鈴薯葡萄糖水培養基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養4 d(107～108孢子數/mL)，按照1%的接種量接種至搖瓶發酵培養基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養4 d，采用對硝基苯酚法測定上清液脂肪酶活力，確定復篩目的菌株。

1.4.1.2 脂肪酶活力測定

采用對-硝基苯酚法，37 ℃、pH 8.0時，1 μmol/min釋放對硝基苯酚所需的酶量為1個酶活力單位[13]，按公式(1)計算：

(1)

式中：A，樣品酶活力，U/L；A1；樣品酶液的吸光度值；A0，滅活酶液的吸光度值；k，對硝基苯酚標準曲線的斜率；k0，對硝基苯酚標準曲線的截距；n，酶液稀釋倍數；V1，酶液體積，mL；t，反應時間，min。

底物溶液A：稱取90 mg對硝基苯酚棕櫚酸，溶于30 mL異丙醇。

底物溶液B：50 mmol/L Tris-HCl，含1%(質量分數，下同)TritonX-100和0.1%阿拉伯樹膠(pH 8.0)。

測定方法:將空白對照和樣品試管作好標記，每支試管中分別加入0.1 mL底物溶液A和1.8 mL底物溶液B，于37 ℃水浴保溫5 min，然后在空白對照管中分別加入0.1 mL酶液和0.1 mL滅活酶液，搖勻，在37 ℃水浴反應10 min后立即加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應，再加入0.5 mL 100 g/L Na2CO3溶液顯色，于410 nm測定吸光度值，每個樣品重復3次。

1.4.1.3 ARTP誘變育種

菌懸液的制備：將復篩目的菌株作為出發菌株，用無菌生理鹽水將斜面菌絲蕩洗并稀釋成濃度為107～108孢子數/mL的菌懸液，備用。

ARTP誘變：吸取10 μL菌懸液于載片中央并涂勻，照射距離2 mm，氣流量10 SLM，功率120 W下進行誘變處理20、30、40、50、60 s，然后用無菌生理鹽水沖洗載片，涂于PDA平板培養基，30 ℃培養3 d，進行菌落計數，3個平行樣本，按公式(2)計算致死率并繪出致死率曲線。

(2)

式中：n，經ARTP處理后平板上平均菌落數；n0，未經ARTP處理平板上菌落數。

脂肪酶活性測定：將誘變后的菌株按照1.4.1.2方法測定脂肪酶活性，并與出發菌株酶活性相比，確定高產脂肪酶活性的突變株，采用PDA試管斜面于4 ℃保存菌株。

1.4.1.4 菌株的鑒定

采用Biolog自動微生物鑒定系統對出發菌株進行鑒定。根據 Biolog FF MicroPlateTM使用說明書，在吐溫-40接種液中輕微研磨制成均勻菌懸液，用濁度計比濁成75% T(T為接種濁度)，將菌懸液加于FF鑒定板檢測孔中，100 μL/孔，于33 ℃ 孵育24～96 h，每24 h讀取結果。

1.4.2 豆豉發酵工藝研究

1.4.2.1 樣品的制備

將黑豆用清水洗凈、浸泡16～18 h，瀝干水分，裝入滅菌袋，每袋200 g，于121 ℃滅菌30 min，放涼，按照1%的接種量分別接入出發菌株GD12菌液(1.6×105孢子/mL)和誘變菌株GD12-11菌液(5×105孢子/mL)，搖勻，于30 ℃恒溫培養，分別于0、3、5、7、9、13、15 d取樣。

1.4.2.2 豆豉中PC、PI、PE的含量測定

采用HPLC法測定不同樣品PC、PI、PE的含量[14]。

色譜條件：Shim-park GIS二醇柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相A:V(正己烷)∶V(異丙醇)∶V(冰醋酸)∶V(三乙胺)=814∶170∶15∶0.8;流動相B：V(異丙醇)∶V(超純水)∶V(冰醋酸)∶V(三乙胺)=844∶140∶15∶0.8; 流速0.8 mL/min;柱溫38 ℃;進樣量10 μL;蒸發光散射檢測器溫度38 ℃；空氣壓力350 kPa。

對照品溶液的制備：精密稱取PC對照品2.69 mg、PI對照品7.86 mg、PE對照品8.13 mg，加入V(正己烷)∶V(異丙醇)=80∶20溶液溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，即得對照品儲備液。

供試品溶液的制備：精密稱取2.0 g豆豉及市售淡豆豉樣品細粉，加入硅膠柱，先用30 mLV(甲醇)∶V(氯仿)=1∶1的溶液洗脫，棄去洗脫液，再用30 mLV(甲醇)∶V(氯仿)=1∶2的溶液洗脫，收集洗脫液，于100 ℃水浴蒸干，用V(正己烷)∶V(異丙醇)=80∶20復溶至5 mL容量瓶，備用。

方法學考察：

(1)線性關系考察。將不同質量濃度的對照品溶液依次進樣，以峰面積為縱坐標(Y)，溶液質量濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得到3種磷脂的線性回歸方程。PC的標準曲線方程：Y=954 814X-8 499.7，R2=0.983(0～0.308 mg/mL)；PI的標準曲線方程：Y=3×10-7X+0.026 1，R2=0.999 7(0～6.05 mg/mL)；PE的標準曲線：Y= 5×10-7X-5×10-5，R2=0.999 1(0～1.40 mg/mL)，在此范圍內線性良好。

(2)精密度試驗。取對照品溶液重復進樣6次，記錄峰面積，結果顯示PC、PI和PE峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)分別為1.42%、1.20%和1.13%，表明該方法精密度良好。

(3)重復性試驗。取同一批次GD12-11發酵9 d的樣品，平行制備供試品溶液6份，分別進樣，記錄峰面積，PC、PI和PE峰面積的RSD分別為1.75%、1.34%和1.57%，表明該方法重復性良好。

(4)穩定性試驗。取同一批次GD12-11發酵9 d的樣品，平行制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄峰面積，PC、PI和PE峰面積的RSD分別為1.42%、1.21%和1.13%，表明室溫下，樣品溶液在24 h內穩定。

(5)加樣回收率試驗。取同一批次GD12-11發酵9 d樣品6份，每份精密稱取2.0 g，分別精密加入3種對照品溶液各1 mL，相當于PC 0.269 mg、PI 0.786 mg和PE 0.813 mg，平行制備供試品溶液，分別進樣，PC、PI、PE加樣回收率分別見表1～表3，表明該方法準確性良好。

樣品中3種磷脂類成分的含量測定：按供試品溶液的制備方法平行制備各供試品溶液，于相同色譜條件測定并記錄峰面積，通過標準曲線計算3種磷脂類成分的含量。

表1 PC加樣回收率Table 1 Recovery rate of phosphatidylcholine

表2 PI加樣回收率Table 2 Recovery rate of phosphatidylinositol

表3 PE加樣回收率Table 3 Recovery rate of phosphatidylethanolamine

2 結果與分析

2.1 出發菌株的篩選及鑒定結果

從淡豆豉飲片中分離篩選出產脂肪酶的菌株5株(表4)，其中GD12酶活力最高，為(4 403±108)U/L，作為出發菌株，采用ARTP技術進一步誘變以獲得高脂肪酶活性的菌株。出發菌株GD12脂肪酶活性初篩平板如圖1，經Biolog微生物鑒定系統鑒定為傘枝梨頭霉(Absidiacorymbifera)。

表4 產脂肪酶菌株的酶活性 單位：U/L

a-中性紅;b-維多利亞藍圖1 GD12脂肪酶活性初篩平板Fig.1 Preliminary screening plates of lipase activity produced by GD12

2.2 ARTP誘變育種結果

2.2.1 誘變時間的確定

圖2為GD12誘變時間-致死率曲線，誘變20 s后該菌的致死率迅速升高，誘變50 s時致死率達到最高為(90±3)%。通常情況下，當致死率>90%，菌株發生突變的概率較高且不易回突，因此，最終采用ARTP誘變處理時間為50 s。

圖2 GD12 ARTP致死率曲線Fig.2 Fatality rate curve of GD12 with the ARTP treatment

2.2.2 高產脂肪酶菌株的選育結果

出發菌株經50 s誘變處理后，將菌液涂于PDA培養基上培養，得到12株突變株，將出發菌株和各突變株通過脂肪酶活性的初篩和復篩，獲得4株脂肪酶活性高于出發菌株的突變株，其中GD12-11的活性最高，脂肪酶活性為(5 547±305)U/L，比出發菌株GD12酶活性提高了25.98%。

2.2.3 豆豉發酵過程中PC、PI和PE的含量變化

2.2.3.1 對照品和樣品的HPLC圖

如圖3所示。相同色譜條件下，PC、PI(純度50%)和PE對照品的保留時間分別為8.7、13.0、7.5 min, 樣品在與對照品色譜峰對應處顯示相同的色譜峰，且分離度較好。

圖3 PC、PI、PE對照品及樣品的HPLC圖Fig.3 HPLC diagrams of PC， PI， PE reference substances and the sample

2.2.3.2 豆豉發酵過程中PC、PI和PE的含量變化

圖4為GD12和GD12-11發酵制備豆豉不同時間PC、PI和PE的含量變化曲線。黑豆未發酵前(0 h)PC、PI和PE的含量僅為(0.049±0.012)、(0.094±0.011)、(0.031±0.002)mg/g，PC于發酵7 d含量達到最高，突變菌株發酵的豆豉PC含量略高于出發菌株，但差異不明顯，7 d分別達到(0.341±0.018)和(0.354±0.012)mg/g，隨后含量逐漸下降，發酵15 d時，含量降至接近發酵前(圖4-a)；PI也于發酵7 d達到峰值，但出發菌株制備的豆豉PI含量高于突變株，含量分別為(3.217±0.011)和(2.395±0.015)mg/g，隨著發酵時間的延長其含量逐漸下降，于發酵15 d降至接近發酵前(圖4-b)；PE在第7天出發菌株發酵樣品含量達到最高為(1.332±0.008)mg/g，突變菌株發酵樣品于第9天達到峰值為(1.399±0.011) mg/g，高于出發株(圖4-c)。對比發酵7 d和9 d豆豉中3種磷脂的總含量，7 d為(3.993±0.034)mg/g，9 d為(3.969±0.021)mg/g，確定7 d為豆豉的最佳發酵時間。

a-PC;b-PI;c-PE圖4 豆豉發酵過程中磷脂類成分含量的變化Fig.4 Content change of phosphlipid in Douchi during fermentation

2.3 新型豆豉與市售淡豆豉3種磷脂類成分的含量對比

如圖5所示，GD12和GD12-11發酵7 d制備的豆豉(新型豆豉)PC含量分別為(0.341±0.016)和(0.354 ±0.012)mg/g，約為市售淡豆豉(0.065±0.008)mg/g的5倍；PI含量分別為(3.217±0.032)和(2.395±0.015)mg/g，約為市售淡豆豉(0.288±0.011)mg/g的為8～11倍；PE含量分別為(1.332±0.021)和(1.244±0.021)mg/g，約為市售淡豆豉(0.042±0.006)mg/g的30倍。新型豆豉3種磷脂類成分的含量均明顯高于市售淡豆豉飲片。

圖5 新型豆豉與市售淡豆豉3種磷脂類成分的含量對比Fig.5 Contents of three phospholipids between new-type Douchi and Semen Sojae Praeparatumon

3 結論與討論

課題組前期從6個產地淡豆豉中分離出14個野生型菌株，包括3株細菌和11株霉菌，其中傘枝犁頭霉為優勢發酵菌[15]。又以傘枝犁頭霉為發酵菌株，考察了淡豆豉和豆豉純種發酵過程中17種游離氨基酸的含量變化，結果表明，隨著發酵時間延長，精氨酸和絲氨酸的含量下降，脯氨酸、組氨酸、谷氨酸和甘氨酸的含量升高，其余氨基酸未發生明顯變化[16]。本研究從淡豆豉中篩選出較高脂肪酶活性的菌株經鑒定也是傘枝犁頭霉，可用于制備富含功能性磷脂型豆豉，傘枝梨頭霉在釀造大曲[17]和豆糝[18]中均有發現，該菌具有很強的耐熱、生長能力，能高產蛋白酶、脂肪酶[19]。本研究從淡豆豉飲片中篩選高脂肪酶活性野生菌株并采用ARTP技術誘變處理，使出發菌株的脂肪酶活性提高了25.98%。出發菌和突變菌發酵制備的豆豉中3種磷脂類成分含量均明顯高于市售淡豆豉，但出發菌和突變菌之間差異不顯著，可進一步采用復合誘變方法以顯著提高菌株的脂肪酶活性，以期更大幅度地提高磷脂類成分的含量。不同磷脂由于其組成的基團不同而具有不同的性質和功能，本研究制備的豆豉中PI和PE的含量明顯高于PC的含量，表明該豆鼓可能具有更好的降血脂作用。有研究證明，豆豉中富含功能性磷脂，并含有大豆異黃酮、活性肽等成分，有利于保護豆豉中功能性磷脂的穩定性[20-21]。

通過優選的菌株制備豆豉，3種磷脂的含量呈先升高再下降的趨勢，可能是由于磷脂在脂肪酶或磷脂酶的作用下進一步水解為甘油磷脂酰膽堿，后續可進一步考察其穩定性。另外，采用優選菌株制備的豆豉中3種磷脂類成分的含量明顯高于市售淡豆豉，可能是由于淡豆豉發酵時間過短或過長而導致磷脂類成分含量較低，或市售淡豆豉發酵菌種復雜多樣，產生的脂肪酶活性較低而不能保證催化反應充分進行，因此，可采用高脂肪酶活性菌種純種發酵制備富含功能性磷脂的豆豉。本研究僅考察了高脂肪酶活性菌株發酵制備豆豉中3種磷脂類成分的含量變化，而功能性磷脂通常連接多不飽和脂肪酸，后續還將通過GC分析豆豉發酵過程中多不飽和脂肪酸含量的變化，為新型豆豉的藥理活性及作用機制研究提供參考。